銀屑靈中芍藥苷在大鼠組織中分布研究

史長燦， 趙瑞芝，2， 盧傳堅(jiān)，2*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州 510006)

銀屑靈片為廣東省中醫(yī)院制劑，此方多用于治療血虛風(fēng)燥型銀屑病，在臨床以及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，療效確切［1-8］。目前是我院治療銀屑病的常規(guī)用藥，其主要由赤芍、土茯苓、莪術(shù)等成分組成。銀屑靈復(fù)方中含有的成分芍藥苷，具有抗炎、抗過敏，調(diào)節(jié)免疫、抑制角質(zhì)顆粒細(xì)胞增生等與銀屑病治療相關(guān)的藥理活性［9-14］，是銀屑靈的主要活性成分之一。藥物體內(nèi)分布與藥效和毒性息息相關(guān)，為了給銀屑靈的后期開發(fā)奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)建立了芍藥苷體內(nèi)分布研究方法，并進(jìn)行了其體內(nèi)分布的研究。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量 (300±40)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 ［合格證號(hào):0081750］，自由飲水進(jìn)食。

1.2 儀器 Agilent1200HPLC，VWD檢測(cè)器 (Agilent);勻漿儀 (IKA，T10);渦旋器 (IKA型號(hào)GENIUS3);單道移液器 ACURA 825(20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，瑞士);電子分析天平 (BT—125D);waters HLB spe柱;超低溫冰箱 (U-570，NEW BRUNSWICK);高速離心機(jī) (G20);Waters20固相萃取儀 (Waters);超純水機(jī) (Milli-Q，Millipore)。

1.3 試劑與藥品 銀屑靈藥材 (康美藥業(yè))，藥物提取液(廣東省中醫(yī)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室制備);芍藥苷 (純度96.5%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司);甲醇 (色譜級(jí)，天津四友);乙腈 (色譜級(jí)，迪馬);乙酸 (色譜純，天津富宇精細(xì)化工試劑公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 分離條件 色譜柱Kinetex C18，(2.6 μm，4.6 mm×100 mm)，檢測(cè)器 VWD，柱溫 30℃，體積流量 1.2 mL/min，檢測(cè)波長275 nm。甲醇-乙腈-0.5%冰乙酸梯度洗脫，見表1。

表1 流動(dòng)相條件

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取適量芍藥苷，用70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL對(duì)照品貯備液，放置4℃冰箱中保存。

2.3 給藥與樣品采集 12只SD雄性大鼠隨機(jī)分為兩組。一組按照8.3 g/kg灌胃給予銀屑靈連續(xù)灌胃6 d，最后一次灌胃2 h后麻醉處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦各組織，另一組按照110 g/kg劑量一次給予大鼠銀屑靈，給藥后2 h處死動(dòng)物，同上述操作取材，分別將心、肝、脾、肺、腎、腦用生理鹽水清洗，用濾紙吸去表面水分，放置在－80℃冰箱中備用。

2.4 樣品處理

2.4.1 樣品準(zhǔn)備 將置－80℃冰箱中保存的組織放至室溫并用濾紙吸干水分，取1 g左右并精密稱定質(zhì)量，加入10倍體積 (w/v)生理鹽水，在冰浴中進(jìn)行勻漿。

2.4.2 處理方法 加入1.0 mL甲醇將spe萃取柱進(jìn)行活化，再加入1.0 mL純水洗去甲醇，將組織液高速離心后取200 mL加入到spe柱，靜置流出組織液后，加1.0 mL的水，靜置流出并抽去水分，加1.0 mL甲醇洗脫spe柱并用EP管收集，置氮吹儀下吹干，再用200 μL的70%甲醇溶解，過 0.22 μL 濾膜，進(jìn)樣 10 μL。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 取空白組織液和加入對(duì)照品的組織液按照2.4.2項(xiàng)方法處理后分別進(jìn)樣測(cè)定，以肝臟組織為例，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，芍藥苷的保留時(shí)間是3.20 min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果沒有影響，專屬性較好。其他組織專屬性圖與肝臟相近。

圖1 大鼠肝臟樣品色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 將大鼠空白組織液，加入系列芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，配制成質(zhì)量濃度為1.6、3.2、8.0、16、40、80、160 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)組織溶液，按照2.4.2項(xiàng)方法處理樣品，以芍藥苷質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，以待測(cè)圖譜峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán) (1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程。各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見表2。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度 根據(jù)不同組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，取三份組織勻漿液加入不同質(zhì)量濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液，制備成3.2、16、80 μg/mL的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，并將3個(gè)質(zhì)量濃度分別制備5份，按2.4.2項(xiàng)下處理后，連續(xù)測(cè)定3 d，分別計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度及準(zhǔn)確度。見表3。

表2 不同組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

3.4 提取回收率 取芍藥苷對(duì)照品組織液低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5份，按2.4.2項(xiàng)下的方法處理，進(jìn)樣測(cè)定得到相應(yīng)峰面積A;另取相同低、中、高3種質(zhì)量濃度的芍藥苷對(duì)照品，上樣測(cè)定得到相應(yīng)峰面積B，將峰面積A與B比較，得到提取回收率，見表3。芍藥苷在不同組織中的提取回收率在78.3%～88.7%。

表3 精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率 (n=6)

3.5 穩(wěn)定性 分別將芍藥苷低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品循環(huán)凍融3次 (－80℃)，以相同方法處理分析，結(jié)果顯示，測(cè)定值和真實(shí)值RSD均小于11%，說明樣品在考察的條件下比較穩(wěn)定;處理后的樣品在4℃放置24 h，室溫放置12 h，經(jīng)分析樣品都比較穩(wěn)定。

3.6 大鼠以8.3 g/kg劑量 (臨床劑量)灌胃銀屑靈，2 h后僅血液中可檢測(cè)到芍藥苷，組織內(nèi)未見芍藥苷，按常規(guī)劑量標(biāo)準(zhǔn)給藥未能測(cè)出組織分布;一次大劑量給予銀屑靈110 g/kg后，組織中芍藥苷質(zhì)量濃度結(jié)果見圖2。

圖2 灌胃銀屑靈后大鼠各組織芍藥苷質(zhì)量濃度

4 討論

姜清華、鄧晶晶等進(jìn)行了大鼠灌胃赤丹丸芍藥苷的體內(nèi)分布研究，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的不同，由于灌胃的藥物處方相差比較大，配伍的成分可能會(huì)對(duì)芍藥苷組織分布內(nèi)有較大的影響。

按照臨床劑量換算的動(dòng)物劑量給予大鼠銀屑靈，芍藥苷僅在血液中可檢測(cè)到，說明正常劑量時(shí)芍藥苷僅分布于血液，提示后續(xù)工藝研究可直接用血液藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)代表服用銀屑靈后芍藥苷的體內(nèi)過程進(jìn)行制劑工藝的優(yōu)化。

大劑量時(shí)芍藥苷主要分布于肝、腎。芍藥苷具有肝保護(hù)作用，大劑量時(shí)主要分布于肝臟，對(duì)于減少處方中其它藥物的肝損傷有積極意義。

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