促進劑對風濕痹痛方中新烏頭堿體外經皮吸收的影響

荊蘊杰， 張文品

(遼寧中醫藥大學附屬第四醫院，遼寧沈陽 110101)

風濕痹痛藥方由草烏、徐長卿、紅花、當歸、三七等六味中藥材組成，為我院治療風寒濕所致諸痛的協定處方。具有祛風除濕、溫經通絡、活血通絡、散寒止痛之功。臨床上采用藥材粉碎，調糊外敷治療風濕類關節病所致之疼痛已有近10年歷史，病例數達上千例，臨床療效確切，沒有出現嚴重的毒副反應。目前促進藥物透皮吸收的方法，最常用的藥劑學方法就是使用透皮吸收促進劑，具有對皮膚作用短暫可逆、刺激性低等優點，為使本方更好的發揮療效，本研究通過體外透皮實驗篩選出透皮促進劑及其比例和濃度。藥方中的草烏具有祛風除濕，溫經止痛之功效為君藥，其所含的生物堿類物質，具有明顯的鎮痛［1］、抗炎［2］作用。因此，本研究選用其中的新烏頭堿的累積透過量作為經皮給藥的評價指標，考察透皮促進劑及其組合的透皮促進作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 改良Franz擴散池 (自制)，Anke TGL-16GC高速臺式冷凍離心機 (上海安亭科學儀器總廠)，磁力攪拌器 (江蘇中正儀器廠)，日立L—7100高效液相色譜儀、日立L-7420紫外檢測器、數據采集軟件天美色譜工作站。

1.2 材料 新烏頭堿對照品 (批號110799-200404)(中國食品藥品檢定研究院)，乙腈、甲醇為色譜純，1，2丙二醇薄荷醇、氮酮等其他試劑均為分析純。風濕痹痛方藥材由遼寧中醫藥大學附屬第四醫院藥劑科提供。Wistar大鼠，雄性，體質量180～220 g，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證SCXK(軍)2007-004。

2 方法

2.1 體外透皮分析方法的建立

2.1.1 檢測波長的確定 稱取適量新烏頭堿標準品用甲醇溶解，制備成約10 μg/mL溶液。按紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版附錄VA)，在200～400 nm波長范圍內掃描其吸收光譜。紫外掃描結果顯示，新烏頭堿標準品在235 nm處有最大吸收，因此確定本實驗中采用235 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS C18柱 (250 mm×416 mm，5 μm);檢測波長235 nm;流動相為乙腈-醋酸銨緩沖溶液 (pH 10.5)(65∶40);體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL;柱溫40℃。

2.1.3 新烏頭堿標準曲線的制備 精密稱取新烏頭堿對照品5.0 mg，用甲醇配成質量濃度為100 mg/L的貯備液。精密移取上述貯備液至10 mL量瓶中，配成質量濃度為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列新烏頭堿標準溶液，以質量濃度對相應的峰面積作回歸計算，繪制標準曲線，得回歸方程:y=6.0×10－7A－4.4×10－3，r=0.999 2。結果表明新烏頭堿質量濃度在0.025～0.5 μg/mL內與峰面積線性關系良好。

2.2 促進劑對風濕痹痛藥方中新烏頭堿體外經皮吸收影響考察［3-8］

2.2.1 實驗樣品的制備 將風濕痹痛藥方藥材粉碎過6號篩備用。依處方量稱取各味藥粉，按等量遞增混勻，以1∶2比例加入蒸餾水攪拌均勻制備成混懸液。

2.2.2 離體大鼠皮膚的制備 將雄性Wistar大鼠 (180～220 g)，用20%的烏拉坦腹腔注射，大鼠達到麻醉狀態，將腹部毛剃凈后，處死。立即用手術剪刀分離腹部皮膚，用眼科手術小剪刀仔細剝離皮下脂肪及結締組織，用生理鹽水漂洗干凈，放入低溫冰箱中保存，7 d內使用，實驗前檢查鼠皮，不得有任何損傷。

2.2.3 透皮擴散實驗方法 用改進的Franz擴散池進行實驗。將處理好的鼠皮固定于擴散池接口處，角質層面向供給池，上下夾緊后，接受池中用注射器通過取樣管將接受液 (pH 7.4磷酸鹽緩沖液)注滿，向供給池中加入4 g供試品，排凈空氣，使之與接受液間無氣泡。水浴溫度(32.0±0.5)℃，磁力攪拌轉子攪拌。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣，每次吸取接收液3 mL，并補加等量接受液，樣品于16 000 r/min低溫離心機離心5 min后，按2.1.2項下條件測定新烏頭堿的量。

2.2.4 數據計算方法 取出的接收液按2.1.2項、2.1.3項方法測定新烏頭堿，并用下面公式計算藥物累積透過量:

2.2.5 考察單一滲透促進劑對新烏頭堿的影響 分別稱取20 g的混懸液，加入不同種類及不同質量分數的促滲劑(1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、3%薄荷醇、5%薄荷醇、10%薄荷醇、5%油酸、5%吐溫-80)混勻，作為供試品，考察對新烏頭堿透皮吸收的影響。

2.2.6 考察合用滲透促進劑對新烏頭堿的影響 在確定最佳單一透皮促滲劑后，選用1%、3%和5%的丙二醇與之合用作為供試品，考察對新烏頭堿透皮吸收的影響。

3 結果

3.1 單用滲透促進劑對風濕痹痛藥方中新烏頭堿頭皮吸收的影響 對實驗數據進行兩樣本雙側t檢驗，與空白對照組相比，加入質量分數為3%、5%的氮酮，3%、5%、10%的薄荷醇，5%的吐溫-80，新烏頭堿的累積透過量和穩態滲透速率有不同程度的增加。加入質量分數為3%的薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量顯著地增加 (P＜0.05)，加3%的氮酮、5%的薄荷醇后穩態通透速率顯著性增加 (P＜0.05)。加入質量分數為1%氮酮、10%薄荷醇、5%油酸顯著縮短了時滯 (P＜0.05)，3%的氮酮極顯著縮短了時滯(P＜0.01)，其他促進劑對時滯無顯著性影響 (P＞0.05)。而加入質量分數為5%的油酸、1%的氮酮后，新烏頭堿的累積透過量及穩態通透速率不但沒有增加，反而降低了，說明5%的油酸、1%的氮酮對新烏頭堿的透皮吸收具有抑制作用，5%的油酸穩態通透速率顯著性抑制 (P＜0.05)。結果見表1，滲透曲線見圖1。

表1 單一促進劑作用下新烏頭堿的經皮吸收參數 (n=3，±s)

表1 單一促進劑作用下新烏頭堿的經皮吸收參數 (n=3，±s)

注:Js為穩態滲透速率，ER為增滲倍數，tlag為時滯，Q12為12 h單位面積累積透過量。*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

促進劑Js/ER空白(μg·h－1·cm －2)Q12/(μg·cm －2)tlag/h 0.41±0.04 4.24±0.60 2.15±0.21 1.00 1%氮酮 0.31±0.03 3.51±0.82 0.58±0.20* 0.76 3%氮酮 0.64±0.03* 7.46±0.84 0.01±0.12＊＊ 1.56 5%氮酮 0.58±0.10 6.76± 0.89 1.44±0.26 1.41 3%薄荷醇 0.68±0.04 7.95±0.42* 0.61±0.35 1.66 5%薄荷醇 0.59±0.04* 6.70±0.04 1.00±0.08 1.44 10%薄荷醇 0.67±0.07 7.70±0.81 0.67±0.09* 1.63 5%油酸 0.25±0.02 2.75±0.24 1.12±0.16* 0.61 5%吐溫-80 0.42±0.04 4.52±0.44 1.57±0.41 1.02

圖1 單一促進劑作用下新烏頭堿的滲透曲線

3.2 合用促進劑對風濕痹痛藥方中新烏頭堿頭皮吸收的影響 對實驗數據進行兩樣本雙側t檢驗，與空白對照組相比，加入質量分數1%丙二醇+3%薄荷醇、3%丙二醇和3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量均顯著地增加 (P＜0.05)，加入1%丙二醇+3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的穩態通透速率顯著性增加 (P＜0.05)，加入3%丙二醇+3%薄荷醇后新烏頭堿的穩態通透速率極顯著性增加 (P＜0.01)，加入均為3%丙二醇+薄荷醇后極顯著縮短了時滯 (P＜0.01)，而加入1%丙二醇+3%薄荷醇、5%丙二醇+3%薄荷醇對縮短時滯無顯著性影響 (P＞0.05)。結果見表2，滲透曲線見圖2。

表2 合用促進劑作用下新烏頭總堿透皮吸收參數 (n=3，±s)

表2 合用促進劑作用下新烏頭總堿透皮吸收參數 (n=3，±s)

注:Js為穩態滲透速率，ER為增滲倍數，tlag為時滯，Q12為12 h藥物單位面積累積透過量。*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

促進劑J s/E R空白(μ g·h－1·c m －2)Q 1 2/(μ g·c m －2)t lag/h 0.4 1±0.0 4 4.2 4±0.6 0 2.1 5±0.2 1 1.0 0 3%薄荷醇+1% 丙二醇 0.8 1±0.0 5* 8.8 0±0.6 1* 1.4 1±0.0 8 1.9 8 3%薄荷醇+3%丙二醇 1.3 6±0.1 6＊＊ 1 5.4 7±1.8 2* 0.4 3±0.1 9＊＊ 3.3 2 3%薄荷醇+5% 丙二醇 0.9 4±0.0 6* 1 1.0 4±1.0 9*1.5 2±0.0 6 2.2 9

圖2 合用滲透促進劑作用下新烏頭堿的滲透曲線

4 討論

草烏是風濕痹痛方中的君藥，發揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質。現代藥理學試驗表明具有鎮痛、抗炎、局部麻醉、抗腫瘤等作用，其中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿是其有效成分［2］，因此選擇了新烏頭堿作為指標化合物，進行中藥復方體外透皮實驗，考察幾種常用滲透促進劑對新烏頭堿的經皮滲透性影響，在一定程度上可以反映體內給藥的效果。

皮膚作為防止外界物質進入體內和體內水分散失的天然屏障，由表皮、真皮和皮下組織構成，其中表皮又可分為角質層和活性表皮，角質層是藥物經皮吸收的主要屏障和限速部位。在增加藥物經皮通透的方法中，使用經皮吸收促進劑能夠增加藥物的經皮滲透能力，減少時滯，提高藥物生物利用度［9］。文獻曾報道通過電子自旋共振光譜發現，薄荷醇可使角質層剛性結構減弱，細胞間脂質的流動性顯著增加，使藥物更容易通過角質層［10］，電阻測定結果表明，應用薄荷醇后人體皮膚的電導率增加，通過打開架支撐的極性孔道，促進藥物的通透［11］。本實驗中加入質量分數為3%的薄荷醇后新烏頭堿的累積透過量顯著地增加 (P＜0.05)。氮酮無色，無味，刺激性小，毒性低，是一種理想的促滲劑，能溶解脂質后形成間隙或使該層細胞間脂質排列有序性下降，增加藥物的透皮吸收［12］。本實驗中加入質量分數為3%的氮酮后，新烏頭堿穩態通透速率顯著性增加 (P＜0.05)。質量分數為3%的丙二醇和質量分數為3%的薄荷醇有協同作用，兩者合用使新烏頭堿滲透速率提高了3.32倍，這可能是由于丙二醇在類脂極性基團之間的親水區域分布，使薄荷醇容易分配進入細胞間部位［13］。

通過研究不同促滲劑對風濕痹痛方中君藥草烏中有效成分之一新烏頭堿透皮吸收的影響，得出質量分數為3%的薄荷醇和質量分數為3%的丙二醇的促滲效果最好，這為風濕痹痛透皮吸收制劑處方的優化提供了理論依據。

中藥，特別是中藥復方，藥味較多，所含成分復雜，體外透皮實驗只能選用有代表性的指標成分進行研究分析，因此實驗結果的真實性和實驗結論的可靠性有待研究。此外，體外透皮實驗失去了機體完整統一的內環境和體液調節，研究結果與整體藥效的相關性，也需要進一步考察［14］。

［1］陳 龍，蔡寶昌，馬 騁，等.草烏幾種炮制品的鎮痛作用比較［J］.中國中藥雜志，1995，20(1):20-22.

［2］程 薇，趙淑英，牛 欣.草烏提取物外用對大鼠足跖腫脹的影響［J］.中華中醫藥學刊，2011，29(2):284-286.

［3］顧圣瑩，丁雪鷹，高 靜，等.透皮促滲劑對雙烏跌打損傷藥方中胡椒堿體外經皮滲透的影響［J］.第二軍醫大學學報，2009，30(4):454-459.

［4］鄭 妮，王 麗，劉曉秋，等.薄荷醇衍生物對蓽茇提取物貼劑中胡椒堿體外經皮通透性的影響［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27(10):772-776.

［5］王 麗，鄭 妮，方 亮，等.滲透促進劑對蓽茇提取物中胡椒堿體外經皮吸收的影響［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27(1):20-23.

［6］馬 蕊，蔣宇軒，牛喜草，等.格列本脲乳膠劑的制備及初步藥效學［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25(11):845-849.

［7］譚 喆，方 亮，張晶穎.格列吡嗪乳膠處方篩選及初步藥動-藥效學［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27(3):174-179.

［8］荊蘊杰，方 亮，郭漢文.促進劑對復方腳癬靈搽劑中小檗堿和黃芩苷體外經皮吸收及其皮內滯留量的影響［J］.沈陽藥科大學學報，2008，25(9):679-683.

［9］李文蘭，王艷萍，季宇彬，等.滲透促進劑對川烏總生物堿和新烏頭堿透皮吸收的影響［J］.中國藥學雜志，2007，42(17):1316-1320.

［10］Barry B W.Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery［J］.Eur J Pharm Sci，2001，14(2):101-114.

［11］趙利剛.新型薄荷醇酯類衍生物經皮促透作用評價及其促透機理的初步研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學，2009.

［12］侯雪梅，李國棟，李衛華.化學促滲劑及機理的探討［J］.上海醫藥，2008，29(5):232.

［13］李 玲，李祖倫，何宇新.不同促滲劑對川白芷中歐前胡素透皮吸收的影響［J］.中成藥，2009，31(4):627-629.

［14］顧圣瑩，丁雪峰，高 靜，等.透皮促滲劑對雙烏跌打損傷方體外透皮吸收和體內藥效的影響［J］.中國藥學雜志，2009，44(8):607-611.