四君子湯傳統煎煮規范化研究

徐秋香， 郁紅禮，2，3， 吳 皓，2，3*， 潘耀宗， 宮 樂， 趙騰斐， 尤奮強

(1.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210029;2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210019;3.國家教育部中藥炮制規范及標準工藝研究中心，江蘇 南京210019;4.昆山市中醫院，江蘇 昆山 215300)

湯劑是我國臨床應用最早、最廣的一種劑型，可適應中醫的辨證施治、隨癥加減的原則，具有吸收快，作用強的優點［1］。中藥療效除了與藥材的質量、炮制方法相關外，煎煮方法尤為關鍵。正如李時珍所說:“凡服湯藥，雖品物專精，修治如法，而煎藥者魯莽造次，水火不良，火候失度，則藥亦無功”［2］;清代醫家徐靈胎:“煎藥之法最宜深講，藥之效與不效，全在于此”［3］。通過查閱大量文獻，同時對臨床煎煮情況進行調研，發現各地煎煮方法差異大。臨床醫生、藥房、湯劑煎煮等相關行業人員大多未有可靠又具事實依據的說法。針對這一現狀，國家中醫藥管理局行業專項對中藥湯劑傳統煎煮方法進行規范化系統研究，目的是制定合理的煎煮操作流程，提高湯劑質量。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術、茯苓、甘草組成，具益氣健脾之功，主治脾胃氣虛證，是補氣基本方［4］。據文獻報道四君子湯有效成分為黃酮類、皂苷類、多糖類及有機酸類等成分［5］，有學者應用液相串聯質譜、質譜-質譜串聯技術對復方四君子湯進行研究，結果表明四君子湯的水溶性成分主要來源于君藥人參和使藥甘草［6］，結合2010版《中國藥典》中人參和甘草質量標準中含量測定指標，選擇湯劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸為指標性成分，并結合湯劑的相對密度和浸出物兩個整體指標，本實驗以四君子湯為研究對象，以浸泡時間、煎煮時間、加水量及煎煮次數為考察因素［7］，采用L9(33)正交設計對四君子湯傳統煎煮工藝進行多指標綜合優選。并比較特殊藥物人參另煎和不另煎方法對湯劑質量的影響，研究不同煎煮器具 (砂鍋、養生壺、不銹鋼鍋)和煎煮火候 (先武后文、一直文火)對湯劑質量的影響［8-9］。本方煎煮的規范化研究，將對補益類中藥湯劑煎煮，特別是貴重藥物的另煎特殊煎煮方法，提供規范化研究的借鑒。

1 材料

Waters2695高效液相色譜儀;waters2589檢測器;UNIQUE-S15超純水發生器;BP211D電子天平 (德國Sartorius公司);KQ—500DE型醫用數控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

人參皂苷Rg1對照品 (批號110703-201027)、人參皂苷Re對照品 (批號110754-200822)、人參皂苷Rb1對照品(批號 110704-200921)、甘草酸對照品 (批號 110731-200614)，購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈 (美國天地試劑公司，色譜純，純度≥99.9%，批號1102374)，其余試劑為分析純。

四君子湯處方:人參9 g，白術9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g。人參 (吉林產，批號110710)、白術 (浙江產，批號110306)、茯苓 (安徽產，批號110513)、炙甘草 (內蒙古產，批號110519)四種飲片均購自南京海源中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸的測定

2.1.1 色譜條件及系統適應性實驗 Thermo Hypersil BDS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.03%甲酸，梯度洗脫，0～14 min，19%乙腈;14～15 min，20.7%乙腈;15～28 min，20.7%乙腈;28～33 min，29%乙腈;33～47 min，41%乙腈;47～52 min，41%乙腈。體積流量為0.9 mL/min;柱溫30℃;人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1檢測波長為202 nm，甘草酸檢測波長為250 nm;進樣體積20 μL。在此色譜條件下人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸能與雜質完全分離，并取得較好的峰形和較高的理論塔板數，效果滿意。

2.1.2 供試溶液的制備 精密量取50 mL四君子湯藥液，置分液漏斗中，用正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量分次溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密量取1 mL人參皂苷Rb1對照品溶液 (1.599 mg/mL)，0.5 mL人參皂苷Re對照品溶液 (1.368 mg/mL)，0.5 mL人參皂苷Rg1對照品溶液(1.522 mg/mL)，混勻即得混合標準溶液。混合標準溶液中人參皂苷Rb1為0.799 5 mg/mL，人參皂苷Re為0.342 mg/mL，人參皂苷 Rg1為0.380 5 mg/mL。甘草酸銨為0.822 4 mg/mL。

2.1.4 精密度試驗 取2.1.3項下的混合對照品溶液和甘草酸銨對照品溶液，分別連續進樣5次，分別對上述4種物質進行定量測定，考察精密度，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸銨的峰面積的RSD值分別為0.61%、0.35%、0.46%、0.35%，均小于3%，說明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，按上述液相條件下分別對4種主要指標性成分進行定量測定，考察方法的重復性，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸的峰面積的RSD值分別0.25%、0.74%、2.66%、2.57%，均符合測定要求。

2.1.6 穩定性考察 同一供試品溶液，室溫下自然放置，分別于0、2、4、8、12、24 h對4種指標性成分進行定量測定，考察樣品的穩定性，結果人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷 Rb1和甘草酸的 RSD值分別為0.84%、0.62%、1.93%和0.47%，均小于3%，表明樣品中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rb1和甘草酸的量在24 h內基本穩定。

2.1.7 加樣回收試驗 精密量取上述已知量的藥液25 mL，共6份，分別加入一定量的對照品溶液適量，依制備供試品溶液項下制備，按上述液相色譜條件方法測定，計算加樣回收率。結果表明人參皂苷Rg1的平均回收率為100.86%，RSD為2.34%;人參皂苷Re的平均回收率為100.57%，RSD為2.95%;人參皂苷Rb1的平均回收率為97.88%，RSD為2.86%;甘草酸的平均回收率為99.25%，RSD為2.97%，表明該方法測定結果準確。

2.2 湯劑相對密度和浸出物的測定相對密度和浸出物

2.2.1 湯劑浸出物的測定 精密量取25 mL藥液 (相當于3.3 g原藥材的質量)，置已干燥至恒定質量的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h至恒定質量，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算得膏率［10］。

2.2.2 湯劑相對密度的測定 參照《中國藥典》2010年版 (一部)附錄ⅦA相對密度測定法中的比重瓶法下的(2)法測定［10］。

2.3 四君子湯傳統煎煮工藝影響因素的優選

2.3.1 煎煮次數的考察 稱取6劑四君子湯，每劑共加20倍量的水，浸泡60 min，分別煎煮1次、2次、3次，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，用外標兩點法計算，得到上述指標性成分的質量濃度，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表1。

表1 不同煎煮次數對湯劑質量的影響

結果顯示，煎煮2次時，湯劑中各指標性成分較煎煮1次都明顯升高;煎煮3次時，湯劑中人參皂苷Rg1反而下降;綜合考慮加水量、煎煮時間及能源消耗等因素，選擇煎煮2次。

2.3.2 浸泡時間的考察 稱取10劑四君子湯，每劑四君子湯加20倍量的水，分別浸泡1、2、3、4、5 h，煎煮2次，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，測定結果如表2。

結果顯示，隨著浸泡時間的延長，湯劑中的主要指標性成分的質量濃度有所增加，但是到一定時間后，其增加幅度減緩。故選擇2、3、4 h作為正交設計表中“浸泡時間”項下的三水平。

表2 不同浸泡時間對湯劑質量的影響

2.3.3 煎煮時間的考察 稱取6劑四君子湯，每劑四君子湯加20倍量水，浸泡4 h，煎煮2次，每次分別煎煮30、60、90 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表3。

表3 不同煎煮時間對湯劑質量的影響

結果顯示，煎煮60 min時，湯劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的量最高。而甘草酸的量及湯劑的浸出物和相對密度隨時間延長而增加。故選擇40、60、80 min作為正交設計表中“煎煮時間”項下的三水平。

2.3.4 加水量的考察 稱取6劑四君子湯，每劑四君子湯分別加12、20、28倍量的水，浸泡4 h，煎煮2次，每次加水量分別為6、10、14倍量［10］，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表4。結果顯示，不同的加水量，湯劑中的指標性成分的質量濃度及湯劑的浸出物，相對密度不同，隨著加水量的增加，湯劑中的主要指標性成分的質量濃度有所增加，考慮到藥液的濃縮時間，故選擇16倍、20倍、24倍量水作為正交設計表中“加水量”項下的三個水平。

表4 不同加水量對湯劑質量的影響

2.4 正交設計法優選四君子湯傳統煎煮工藝研究 (人參與其余藥味合煎) 在確定煎煮次數為2次的基礎上，以浸泡時間、煎煮時間和加水量為考察因素，結合上述四君子湯煎煮工藝影響因素研究的結果，每個因素下設定三個水平，其因素水平表見表5。

表5 因素水平

2.4.1 正交試驗設計與方差分析 四君子湯質量綜合評分方法:三種人參皂苷和甘草酸的加權系數分別為0.7和0.3;三種人參皂苷量總和評分=(三種人參皂苷量之和/三種人參皂苷量之和最大值)×0.7×100;甘草酸量評分=(甘草酸量/甘草酸量最大值)×0.3×100。綜合評分=三種人參皂苷量綜合評分+甘草酸量評分。本研究L9(33)正交實驗綜合評分結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 L9(33)正交試驗設計和結果

表7 四君子湯傳統煎煮正交工藝方差分析

直觀分析結果可知，各因素對湯劑質量的影響程度為C＞A＞B＞D，D為誤差項，即影響湯劑質量的主要因素依次為加水量、浸泡時間、煎煮時間。方差分析結果可知，因素C(加水量)對湯劑質量有顯著性影響，因素A(浸泡時間)和因素B(煎煮時間)對湯劑質量無影響。同時為縮短湯劑浸泡煎煮的總時間，故四君子湯煎煮工藝最佳組合A1B2C3。即取一劑量的四君子湯，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，合并藥液。

2.5 湯劑煎煮文火與武火比較研究 按照上述優化出的工藝煎煮，比較文火和武火的差別。文火操作為一直采用文火加熱煎煮。武火操作為先用武火加熱煮沸，然后用用文火保持微沸狀態。平行3次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表8。

表8 不同火候對四君子湯質量的影響 (n=3)

由結果可見，先武火后文火相較于一直用文火加熱煎煮，人參皂苷的量顯著下降，故四君子湯煎煮應該采用一直用文火慢燉的煎煮方法。此結果與傳統煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉的方法一致。

2.6 不同煎煮器具的比較研究 中藥湯劑煎煮器具與湯劑質量密切相關，歷代醫藥學家對湯劑煎煮均很重視。如陶弘景說:“溫湯忌用鐵器”［11］，作者分別采用不銹鋼鍋、砂鍋和養生壺，按照優化工藝煎煮，比較三種煎煮器具對湯劑質量的影響。每種煎煮器具平行3份。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表9。

表9 不同煎煮器具對四君子湯質量的影響 (n=3)

綜合上述結果可知，不銹鋼鍋、砂鍋和養生壺對四君子湯中4種指標性成分量的煎出率高低順序為養生壺＞砂鍋＞不銹鋼鍋，而且不銹鋼鍋的煎出率明顯低于養生壺和砂鍋。養生壺煎出有效成分的效率最高。這可能與養生壺煎煮火候穩定有關。

2.7 四君子湯人參另煎方法研究 四君子湯中，人參另煎，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮時間和次數見表10。其余3味藥白術，茯苓，炙甘草采用2.3項下的最佳工藝，即加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，將煎出液與人參另煎液合并。每份平行3次。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表10。

表10 不同的煎煮次數和煎煮時間對湯劑質量的影響 (n=3)

由結果可知，人參另煎煎煮2次，每次60 min，湯劑中主要指標性成分量最高。因此人參另煎的煎煮工藝為加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min。

2.8 人參另煎與不另煎的驗證比較實驗 稱取6劑四君子湯，分別以人參另煎與不另煎兩種最佳工藝煎煮，考察人參另煎對湯劑質量的影響。平行3份。湯劑中4種指標性成分測定按2.1項下方法進行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進行，結果如表11。

表11 人參另煎與不另煎對湯劑質量的影響 (n=3)

由圖表結果可知，人參另煎湯劑中的主要藥效指標成分的量都略高于共煎液。這一實驗結果驗證了人參另煎這一傳統煎煮方法的合理性。

綜合以上結果，四君子湯傳統煎煮最佳工藝為將人參置于砂鍋或養生壺中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加熱煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。其余三味藥置于砂鍋或養生壺中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加熱煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。

3 討論

本研究首次對比了不同煎煮器具在中藥湯劑煎煮過程中對湯劑質量的影響，結果顯示采用不銹鋼鍋、砂鍋和養生壺煎煮，四君子湯煎液中4種指標性成分及湯劑的浸出物和相對密度的高低順序為養生壺＞砂鍋＞不銹鋼鍋，而且不銹鋼鍋的煎煮量明顯低于養生壺和砂鍋。其原因可能是不銹鋼鍋傳熱快，火力不好控制，容易將藥煎糊，需要不斷攪拌，且在煎煮的過程中，損失了大量的水分，導致加水量變化極大，不利于湯劑有效成分的煎出。砂鍋具導熱均勻、緩和，化學性質穩定，不會與中藥有效成分發生化學反應，藥鍋保溫性好等優點，且養生壺具有可控制火候的功能［12］。由實驗結果可見，養生壺煎出的有效成分的量最高，故認為養生壺煎煮湯劑最好。為臨床湯劑煎煮過程中，怎樣正確的選擇煎煮器具提供了科學依據。

本研究以四君子湯作為補益劑的代表方，比較了不同煎煮火候對中藥補益劑質量的影響，結果顯示先用武火后文火相較于一直用文火，人參皂苷的量顯著下降，故補益類中藥湯劑四君子湯煎煮應該采用一直采用文火慢燉的煎煮方法。此結果為傳統煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉提供了科學參考依據。

本研究首次比較了人參另煎與不另煎對湯劑質量的影響研究，結果顯示人參另煎的湯劑中主要藥效指標成分的量都略高于共煎液。原因可能是因為處方中的茯苓含有大量的淀粉，隨著煎煮時間的延長，其糊化程度亦隨之增加，從而使煎液中的吸附和包容現象也增加，湯劑中主要指標性成分不易溶出。此結果為傳統煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉提供了科學參考依據。

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