蜂膠黃酮對環磷酰胺誘導HL7702細胞損傷的保護作用

張 良

蜂膠是經驗豐富的工蜂采集生命力極強的白楊、白樺、榕樹等嫩芽和花蕾及樹脂類物質，歸巢后幾番吐哺，與其舌腺分泌物混合而制成的膠粘物質。蜂膠乙醇提取物(EPF)中含有豐富的黃酮類化合物、脂肪酸及酯類、氨基酸、維生素和多種活性酶類。研究發現，蜂膠黃酮(EPF)對環磷酰胺(CTX)致肝正常細胞HL-7702損傷具有保護作用，為證實此觀點，筆者進行了動物實驗，旨在進一步研究并證實EPF對化療藥物損傷的保護作用，為進一步將其開發為新型高效的天然抗腫瘤藥物和細胞保護劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 EPF:由日本醫科大學生命科學中心采用乙醇提取，紫外光譜鑒定并定量檢測。人正常肝細胞(HL-7702)由日本醫科大學生命科學研究中心提供。WST-1凋亡檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Qiagen公司;氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)試劑盒、EB/溴化乙錠、吖啶橙購自羅氏公司。BALB/C野生型小鼠，6周齡(購自日本琦玉縣KUREA株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養液中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，2～3 d傳代一次。細胞生長曲線實驗:將對數生長期的HL7702細胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液吹打成單細胞懸液，調整細胞密度為1×104/mL，每孔100 μL，分別加入到4塊96孔培養板中，置于37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養。24 h細胞貼壁后，向各孔中分別加入 CTX 4 ng/L、EPF(20、30、40 ng/L，每個濃度設5個復孔)。分別培養24 h，PBS沖洗3次后，各孔加入100 μL無血清培養基和10 μL WST-1，繼續在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養1 h。酶標儀測定各孔OD值(光密度)，空白孔調零，選擇450 nm為測定波長、630 nm為參考波長，以藥物濃度為橫坐標、OD為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次，確定結果穩定性。

1.2.2 蜂膠黃酮提取 稱取蜂膠1.0 g，乙醇加至100 mL，漩渦混合，超聲波發射器超聲20 min，500 r/min離心2 min，重復超聲處理20 min，反復上述步驟2次，70%乙醇溶解并紫外光譜分析儀鑒定，陽性對照為蘆丁。

1.2.3 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色實驗24孔板按5×104個細胞/孔密度接種細胞懸液，培養24 h后向各孔中分別加CTX(4 ng/L)、EPF(20、40、60 ng/L)，繼續培養 24 h，棄去培養基，PBS清洗2遍，每孔分別加200 μL AO染液(100 mg/L)及 200 μL EB 染液(100 mg/L)，室溫放置5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理方法同上，PBS清洗細胞2次，0.25%胰酶消化細胞，500 r/min離心5 min收集細胞。收集1×106單細胞懸液，加入Binding buffer 100 μL和 Annexin-V-FITC(20 μg/mL)10 μL，室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/mL)5 μL，用 Binding buffer加至400 μL，用FACS進行流式細胞術定量檢測。

1.2.5 動物模型 健康鼠隨機均分為5組，雌雄各半。對照組灌胃生理鹽水;模型組單獨給予CTX;3個劑量試驗組每天分別灌服樣品100、200、400 mg/mL，0.5 mL/只，連續給藥 10 d，同時注射CTX 0.15 g/kg，共3 d。小鼠眼眶取血檢測外周血象，肝素抗凝，根據試劑盒操作過程分析檢測血清檢測中各項酶的指標。

1.2.6 統計分析 應用SPSS 13.0統計軟件。計量數據以xˉ±s表示，兩組均數間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制影響對人肝細胞系HL7702生長增殖的影響，如圖1所示，在單獨存在CTX(4 ng/L)時，HL-7702均處于生長抑制狀態;加入EPF時，實驗組細胞生長抑制明顯改善，并隨著EPF多肽濃度的增加，當EPF濃度達到40 ng/L時，促進生長作用顯著增加，各組與陰性對照組比較差異有統計學意義。結果顯示，EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

圖1 EPF對CTX處理HL-7702的保護作用

2.2 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態影響 見圖2。結果顯示，單獨應用CTX(4 ng/L)組，絕大部分細胞核被染成橙紅色，核皺縮或碎裂，為晚期凋亡或死亡細胞。EPF與CTX聯合應用，EPF肽強烈抑制CTX對HL7702的損傷作用。凋亡細胞明顯減少，絕大多數細胞形態飽滿，幾乎沒有死亡細胞。AO/EB染色實驗結果表明，從形態角度觀察，EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態影響具有抑制作用。

圖2 EPF對CTX處理的HL7702AO/EB雙染結果

2.3 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡影響Annexin-V-FITC/PI染色，流式細胞術分析細胞凋亡實驗結果見圖3。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h晚期凋亡細胞占30.2%，CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占19.2%、13.1%和7.1%，隨著EPF濃度增加，凋亡細胞逐漸減少，活細胞和早期凋亡細胞明顯增多。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h早期凋亡細胞占57.2%，CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占29.7%、17.1%和9.5%，隨著EPF濃度增加，早期凋亡細胞逐漸減少，活細胞明顯增多。

2.4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響 如圖4所示，模型組小鼠血清CAT、LDH、CK、GOT和GPT等酶活性以及血清BUN含量與對照組差異有統計學意義，然而此類CTX介導的毒性反應均在一定程度上被EPF緩解。

圖3 EPF對CTX處理的HL7702細胞凋亡率影響

圖4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響

3 討論

惡性腫瘤的治療手段有多種，化療仍是目前極為重要的基本手段之一［1-2］，且存在靶向性差異。多數抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細胞的同時，無選擇地破壞正常組織，造成廣泛與嚴重的急/慢性蓄積毒性，導致化療藥物的劑量限制而引起治療指數狹小的不良反應，限制了癌癥治療的最佳用藥［3］。同時，化療藥物作用可引起機體衰弱、消化障礙、骨髓抑制等不良反應也是終止腫瘤治療的主要原因，因此，在抗腫瘤治療時，能最大程度地殺傷腫瘤細胞且對正常組織破壞最小已經成為化療藥物臨床應用的目標。其相關研究也是當今抗腫瘤藥物研究與開發領域的一大熱點［4］。

蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽和枝條上采集的樹脂類物質，蜂膠提取物無明顯肝腎功能損害。其在不同地區化學成分各異，生理活性亦不同。筆者采用乙醇純化方法提取的蜂膠主要成分為黃酮類。黃酮化合物有抗菌、抑制腫瘤細胞生長、降壓、預防紫外線損傷等作用。筆者前期研究發現EPF具有較好的化療保護功能，并通過細胞實驗和動物實驗結果證實。為探求EPF對于CTX損傷HL7702細胞的保護作用，本研究采用WST-1細胞增殖試驗。WST-1是一種類似于MTT的化合物，是MTT的升級替代產品，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。故實驗結果更加精確可信。

在本研究中，在HL7702細胞培養液中分別加入CTX和不同濃度的EPF(20～40 ng/L)，培養24 h，細胞的增殖抑制在EPF濃度達到20 ng/L后得到改善，EPF濃度到40 ng/L后具有明顯的保護作用，同樣 AO/EB雙染實驗和 Annexin-V-FITC/PI流式細胞實驗也支持這一實驗結果。

動物實驗結果進一步確定EPF對CTX化療損傷的保護作用，這可能與EPF具有抗氧作用有關。EPF可以清除體內過多的自由基，減少自由基對機體正常細胞的損傷，維持體內抗氧化系統的平衡，有效抑制CTX造成的機體自由基損傷［5-6］，表現為血清CAT下降，同時對CTX導致的肝損傷具有明顯的保護作用，表現為GOT與GPT下降。本研究顯示，CPF具有對CTX引起的化療損傷較明顯的保護作用，為進一步研究和應用提供理論依據。

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［1］Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk［J］.Ann Stomatol(Roma)，2012，3(1):31-36.

［2］Min Wu，Mark R，Kelley W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(4):755-761.

［3］Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells［J］.Cancer Res，2000，60(18):5187-5195.

［4］馬培奇.細胞保護劑氨磷汀及其臨床應用及展望［J］.中國腫瘤，2001，10(8):471.

［5］Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model［J］.Science，1998，279(5349):377-380.

［6］Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis［J］.Methods，2009，48(2):188-192.