經手術切除甲狀腺和嗅球的大鼠有可能成為一種難治性抑郁癥的實驗動物模型

（廣西醫科大學人體解剖學教研室，廣西 南寧 530021）

由于難治性抑郁癥（treatment-resistant depression,TRD）的病因復雜，發生機制仍未完全清楚，并對抗抑郁藥物等治療措施表現出不敏感甚至發生抵抗[1,2]，這不僅對患者產生消極影響，而且給其家庭帶來沉重負擔，故揭示此病的原因與發病機制并制定出良好的綜合治療方案顯得尤為重要。經過長期不懈的探索，目前發現部分 TRD患者伴有亞臨床或隱性甲狀腺功能低下的現象[3,4]，而且聯合應用抗抑郁藥物與甲狀腺素治療這類患者竟然可以糾正相關癥狀[5,6]，提示甲狀腺功能低下可能是促進原發性抑郁癥轉變成為 TRD的一個誘因。為闡明伴有甲狀腺功能障礙 TRD的病理變化緣由及其外在表現過程，有必要通過建立動物模型來加以鉆研[7]。然而，在這方面迄今仍未見有完全應用外科手術方式制作動物模型的有關報道。鑒于存在這種不足之處，本研究通過外科手術切除大鼠甲狀腺和嗅球建立相應的 TRD模型；測試由此大鼠模型所誘發的行為變化的模式與程度，進而分析這個模型的可行性，為今后從事藥物篩選及用藥物干預提供基礎性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）實驗動物

清潔級健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠 30只，體重為150～200g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK桂 2009-0002。在領取到大鼠后，將大鼠置于本教研室的實驗動物室內，用大小鼠維持飼料[北京科澳協力飼料有限公司生產，飼料生產企業審查合格證號：京飼審（2009）06166，執行標準：GB14924.3－2010]飼養 1周，在自然光照條件下讓大鼠自由飲水與攝食，以適應于新環境，隨后手術建立動物模型。

（2）試劑與儀器

吸收性明膠海綿由南昌市祥恩堂醫療器械有限公司生產。阿莫西林膠囊由哈藥集團三精明水藥業有限公司生產。葡萄糖酸鈣片為山西振東泰盛制藥有限公司的產品（規格：0.5g/片，產品批號：20130203）。4號不銹鋼牙科磨鉆為日本MANI INC公司研制。Morris水迷宮測試系統由中國醫學科學院藥物研究所研制。江灣I型C大鼠腦立體定位儀由上海花木農機廠研制。曠場試驗（open field test）的立體敞箱、強迫游泳試驗（forced swimming test）的圓柱體容器為本科室分別根據其他學者的報道[8,9]自行制作。

1.2 方法

（1）動物分組

采用隨機數字表法，將30只大鼠隨機分成3組，每組10只：模型組、假手術組、正常對照組。

（2）動物模型的建立

按照其他學者已報道的方法[10]，對模型組大鼠進行甲狀腺切除術，主要步驟如下：3.5%水合氯醛（350mg/kg體重）腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥，常規消毒與備皮，沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離皮下組織與肌肉，充分暴露甲狀腺，將甲狀腺的兩側葉及中間的峽部完全切除掉，止血并逐層縫合傷口。術后按常規用含有10%葡萄糖酸鈣的自來水讓模型組大鼠飲用直到本研究完全結束為止[11]，并讓大鼠恢復 1周。繼之再對模型組的大鼠行雙側嗅球切除術，按照其他學者已報道的方法[12]，將大鼠頭部固定在大鼠腦立體定位儀上，暴露出顱骨，在距前囟前7～8mm處與顱骨頂部正中線兩側各旁開2mm的相交點處，用牙科磨鉆將顱頂骨鉆出兩個直徑約2mm的小孔，將微小探針伸入到小孔內，不斷攪動將嗅球破壞成末糊狀，再用橡皮吸引器將其輕柔地吸出到小孔以外，迅速將吸收性明膠海綿填充到小孔內止血，逐層縫合傷口。在依次完成以上兩種手術后，均將阿莫西林粉末投入傷口內或傷口縫合處，防止感染。對于假手術組大鼠的兩次手術，除了不切除甲狀腺和雙側嗅球外，其余步驟均與上述手術的完全相同，對于正常對照組的大鼠則不進行任何處理，但對這兩組的所有大鼠均用自來水供其飲用，而飼養料則與模型組大鼠的完全相同。在嗅球切除術后的第15天做行為測試。

（3）曠場試驗[8]

此實驗是在一個用金屬板（厚度約0.2 cm）制成的立體形敞箱內進行的。此箱的長度和寬度均為80cm，高度為40cm，用黑色油漆涂于其內表面，在底部以邊長為15cm的等長度，將其劃分成為 25個正方形格子（15cm×15cm）。實驗時將大鼠輕放入到底部的中央格子內，然后記錄大鼠在3min內走動跨越過格子的總數（在本研究中，只有當大鼠的兩前肢與一后肢同時進入格子內才被確定為越過一格，即水平活動得分，crossing score，單位：格）；同時記錄大鼠兩前肢完全離開地面的向上站立次數（即垂直活動得分，rearing score，單位：次）。此試驗測定大鼠的活動程度與焦慮狀態，實驗在上午8∶00～11∶00時間段進行。

（4）強迫游泳試驗

完全按照Porsalt等的設計[9]，用厚度為0.4cm透明無色的有機玻璃板做成內直徑為18cm，高度為40cm的圓柱體容器。在預適應試驗時，先將自來水倒入到該容器內，使水量達到18cm的高度（水溫24～26OC），再將每只大鼠放入到該圓柱體容器內15min。大鼠首先有不斷掙扎、奮力游泳或潛水等表現，但經過數分鐘后大鼠知道是不可能逃出該容器的，于是變得活動次數越來越少，最終保持只有鼻孔露出水面的不動狀態。通過上述預訓練后，讓大鼠休息24h，第二天將大鼠放入到盛有等體積水的圓柱體容器內，記錄在 5min內的不動時間（immobility time，單位：秒）。在本研究中，大鼠在5min內必須是有明顯的主動向周圍游泳或向上竄爬或潛水等才被認定為游泳狀態，而大鼠只有被動性的微小前肢活動，并以此來保持鼻孔露出在水平面上呼吸，則被認定為不游泳（不動）狀態。此試驗是測定抑郁癥最嚴重癥狀之一絕望狀態的有效方法，被測試大鼠的不動時間越長，表示其絕望程度越嚴重。實驗在下午14∶30～17∶30時間段進行。

（5）水迷宮測試

先將各組大鼠放入到盛有自來水的圓形游泳池（直徑156cm，用黑色油漆涂于其內表面，水溫為24～26OC）內，讓其自行游泳2min以適應于即將被測試的環境。在適應性訓練后24h，即進行航行定位試驗：每只大鼠分別被從游泳池的4個不同的固定位置，在保持大鼠的頭面部朝向池壁的條件下輕放入水中，記錄每次在2min內，每只大鼠自行找到并爬上所放置的平臺（直徑為10cm, 高度為28cm，使平臺頂部低于水平面1cm）的實際時間，共計4次，即為逃避潛伏期（單位：秒）。每日在上午（8∶00～12∶00）與下午（14∶30～18∶30）兩個時間段進行，共連續測試4天（8個時間段）。逃避潛伏期越長，表示空間學習能力越差。在試驗的第 5天，將放置在游泳池內的平臺取出，然后進行空間探索試驗：將大鼠從游泳池的一個固定點輕放入水中（頭面部朝向池壁），記錄大鼠在2min內自行在原來放置平臺象限內的實際游泳時間（在平臺象限時間，單位：秒）。在平臺象限游泳時間越長，表示空間記憶能力越強。

（6）固定與檢查手術效果

在完成全部行為測試后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開胸經左心室插管至升主動脈, 用4%多聚甲醛（0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH7.4）原位灌注固定大鼠。固定完畢首先打開頸部，查看甲狀腺被切除的狀況，繼之打開大鼠顱蓋骨暴露出整個腦，檢查雙側嗅球被切除的程度。經過以上細致的復查證實，用于本研究的模型組大鼠的甲狀腺均已被完全切除掉；并將切除雙側嗅球（包括副嗅球）均達到70%以上且同時不損傷兩側前腦的模型組大鼠用于本研究，對于達不到上述要求的大鼠則從實驗中剔除，一律不將他們的數據用于本研究的統計分析。

（7）統計學方法

用SPSS13.0統計軟件中的單因素方差分析對原始數據進行統計處理。經統計得出的所有計量數據用均數±標準差（±s）表示。對于方差齊的各組均數間的兩兩比較用最小顯著性差異檢驗，對于方差不齊的各組均數間的兩兩比較則用Games-Howell檢驗。所有統計界限均以雙側α=0.05作為判斷各組之間相互比較差異具有統計學意義的水準。

2 結果

2.1 一般變化

模型組大鼠在接受甲狀腺切除術后的第2～3天，便可恢復自由飲水與攝食，從這時到術后第 7天為止，模型組大鼠在攝食、飲水、活動等方面與假手術組大鼠或正常對照大鼠的基本相似。然而，在模型組大鼠再次接受雙側嗅球切除術后的第 6～14天，大鼠在鼠籠中走動過多，易被激怒、主動攻擊或撕咬同伴，雙方發生猛烈爭斗；在手術后的第20～28天，這些行為變化程度逐漸減緩，同時大鼠身體變小，生長緩慢，毛發失去光澤變得粗糙，體重明顯下降（與正常對照組大鼠或假手術組大鼠相比較，差異有統計學意義,P＜0.01，見表2）。相比之下，假手術組或正常對照組大鼠則無上述行為變化，兩組大鼠的體重也相互接近，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.2 曠場試驗與強迫游泳試驗結果

在曠場試驗中，模型組大鼠行走跨過的水平格子數、垂直站立次數大約是正常對照組或假手術組大鼠的 2倍多，與后兩組相比較的差異有統計學意義（P＜0.01），但正常對照組大鼠與假手術組大鼠的這兩個指標之間的差異卻無統計學意義（P＞0.05）。在強迫游泳試驗中，模型組大鼠的不動時間也大約是正常對照組或假手術組大鼠的 2倍多，與后兩組之間的差異也有統計學意義（P＜0.01），而正常對照組大鼠與假手術組大鼠之間的差異則無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 三組大鼠曠場試驗與強迫游泳試驗的結果比較（±s）

表1 三組大鼠曠場試驗與強迫游泳試驗的結果比較（±s）

注：與正常對照組或假手術組比較，米P＜0.01

組別 鼠數 水平格子數（格） 垂直站立數（次） 不動時間（秒）正常對照組 10 29.70±8.23 5.40±1.71 72.80±19.23假手術組 10 33.80±11.56 6.00±2.87 68.60±17.02模型組 10 94.20±19.26 米 13.80±3.61米 148.40±30.44米

2.3 水迷宮測試結果

模型組大鼠的逃避潛伏期[4天（8個時間段）測試得到的總體均數±標準差]大約是正常對照組或假手術組大鼠的2倍，與后兩組之間的差異具有統計學意義（P＜0.01），但正常對照組大鼠與假手術組大鼠之間的差異卻無統計學意義（P＞0.05）。相比之下，模型組大鼠在原平臺象限實際游泳時間則分別比正常對照組、假手術組大鼠縮短了89.6%和84.1%，與后兩組之間的差異也有統計學意義（P＜0.01），而正常對照組大鼠與假手術組大鼠之間的差異則無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 三組大鼠體重與水迷宮測試的指標變化（±s）

表2 三組大鼠體重與水迷宮測試的指標變化（±s）

注：與正常對照組或假手術組比較，米P＜0.01

組別 鼠數 體重（克） 逃避潛伏期（秒）在平臺象限時間（秒）正常對照組 10 309.60±16.37 21.32±7.16 65.40±7.82假手術組 10 301.10±8.66 22.45±6.87 63.50±10.61模型組 10 243.70±19.74米48.16±17.36 米 34.50±10.20米

3 討論

在機體的正常狀態下，甲狀腺合成與分泌甲狀腺素（四碘甲腺原氨酸，T4；三碘甲腺原氨酸，T3）是受到其上級器官——下丘腦和垂體控制的，他們自上而下形成了下丘腦——垂體——甲狀腺的神經內分泌軸，從正、反兩個途徑進行相互調節。一方面，下丘腦分泌促甲狀腺素釋放激素（TRH），促進垂體合成與分泌促甲狀腺素（TSH），TSH則刺激甲狀腺合成與分泌 T3和T4，后兩者最終通過作用于靶細胞內的受體，產生相應的生物學效應。另一方面，垂體或甲狀腺所分泌的相應產物，根據體內與體外的變化，又可反過來對上一級器官的內分泌活動施加負反饋影響，使這三個器官的活動彼此協調，進而確保此軸在總體功能上處于相對的平衡狀態，以便更有效地針對機體內外的刺激做出適宜應答[13]。

但在臨床上可觀察到，一些伴有甲狀腺功能障礙 TRD患者血清的抗甲狀腺抗體(抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺微粒體抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體)滴度升高、T3與T4水平下降以及TSH水平升高等生物化學指標的異常變化[2～4]，由此可以推測，患者體內的免疫系統產生了針對甲狀腺的自身抗體，專門瞄準甲狀腺而發動攻擊，使甲狀腺受到損傷，導致其合成分泌T3與T4的量減少，并對TSH的刺激呈現出反應遲鈍；在這種狀態下，TRH不得不再次催促垂體進一步分泌TSH來迫使已受損的甲狀腺増加內分泌活動，導致 TSH異常升高。即便已有以上生物化學指標異常，這類患者此時依然不出現甲狀腺功能低下的明顯臨床癥狀，而是處于缺乏相應癥狀的亞臨床或隱性甲狀腺功能低下的異常狀態[1,3]。然而，甲狀腺本身的這些病變及其隱性功能低下卻很有可能加劇了患者原有抑郁癥的病理生理的連鎖反應，使抑郁癥的核心臨床癥狀，如心境低落、興趣減退、絕望及伴有焦慮、學習記憶障礙等變得更具有遷延性和抵抗性，造成單獨用抗抑郁藥物或甲狀腺素治療無法消除這些癥狀，必須同時聯合應用這兩種藥物治療才能控制的嚴重后果[5,6]。由此可見，甲狀腺功能低下與抑郁癥共存、相互影響，可促進抑郁癥朝向縱深方向發展，最終演變成為對藥物治療不起反應的TRD，故甲狀腺功能低下與抑郁癥可能是引發這類TRD的兩個源頭性因素。

基于以上臨床資料與推測，我們以甲狀腺功能低下與抑郁癥作為建立動物模型的兩個基本前提，針對性地切除同一只大鼠的甲狀腺及其雙側嗅球，然后追蹤觀察并測試在手術后所誘發的行為變化，相關結果顯示：模型組大鼠表現出生長緩慢、 易激怒、焦慮樣行為、絕望狀態及空間學習與記憶能力明顯下降等，這些變化不僅與正常對照組或假手術組大鼠相比較差異有統計學意義（P＜0.01），還與其他學者在切除甲狀腺或切除嗅球實驗中所觀察到的基本一致[14,15]，提示本研究的大鼠模型出現了伴有甲狀腺功能低下的激越性抑郁樣行為。

既往研究表明，單純性甲狀腺切除術是模仿甲狀腺功能低下的一種常用術式[10]，通過切除甲狀腺，消除甲狀腺源性T3和 T4的來源，使模型動物出現生長發育停滯、抑郁樣行為及學習記憶障礙等變化[15]。此外，其腦內的結構與神經遞質（5-羥色胺、去甲腎上腺素等）也受到負性影響[1,7]。而單純性嗅球切除術則是一種建立抑郁癥模型的術式，在切除嗅球后，腦內可出現由此所觸發的次生性結構損害與神經遞質變化（杏仁核-海馬-皮質環路、中縫核、藍斑以及5-羥色胺、去甲腎上腺素等均遭受波及）[16～18]，模型動物表現出激越、抑郁樣行為、學習記憶障礙等[12,14]。從上述可見，通過分別應用這兩種手術建立的相應動物模型均有各自獨特的原因、病理變化與行為表現，使得它們成為經得起考驗的公認動物模型[15,17]。本研究在此基礎上，先后將這兩種手術有機結合起來，制成了對應的大鼠模型，不僅其原因與手術方式明確；而且在長生發育方面，含有甲狀腺功能低下的外顯成份，如生長緩慢及停滯、體重明顯下降；但易激怒、主動攻擊、撕咬、過度活動等卻是嗅球切除的外顯成分；而絕望狀態和空間學習記憶障礙則很可能是通過甲狀腺切除與嗅球切除兩者共同施加影響而產生的最后表現。從本研究的模型可看出其行為變化的多樣性，也提示在這些行為外觀變化的背后或許潛藏著復雜的抑郁癥病理變化，并可能具有持續的頑固性，導致單一用藥治療失敗。若以上述作為背景并與伴有甲狀腺功能低下 TRD的臨床特征相比較即可見，本研究的大鼠模型在原因和行為變化方面與該 TRD的相應指標較為類似，因此其可能是模仿伴有甲狀腺功能低下難治性抑郁癥激越亞型的一種實驗動物模型。此外，本研究所建立的大鼠模型出現異常行為的時間也較長（4～5周），這為長期聯合應用藥物治療及觀察療效提供了時間保障。

總之，通過綜合與伴有甲狀腺功能低下 TRD相互比較與分析的結果可初歩認為，本研究建立的大鼠模型既有理論基礎，又在病因與行為變化上與該病的有關臨床特征較為相似，故由本研究所建立的大鼠模型可能具有潛質成為模擬伴有甲狀腺功能低下 TRD亞型的一種動物模型；加上該模型出現異常行為的持續時間較長，也適合用于今后進行長期藥物干預并揭示相關藥理學機制的研究，如此也可通過后續工作來再次印證該模型的重復性、可靠性與實用性，使得本模型變得更為成熟。

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