降解阿維菌素耐高溫菌株AZ11 的分離及降解特性

魏艷麗，李紀順，扈進冬，張廣志，李紅梅，楊合同

(山東省科學院生物研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014)

阿維菌素(abamectin)是從阿維鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的一種高效、廣譜、低殘留生物農(nóng)藥［1-2］。我國阿維菌素原藥生產(chǎn)大型企業(yè)有7 家，生產(chǎn)能力為800～1 000 噸/年［3］。阿維菌素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢棄藥渣，這些藥渣中含有豐富的營養(yǎng)成分及未分離完的阿維菌素，無論將其作為肥料還是飼料原料使用，均能從不同方面、不同程度上破壞生態(tài)鏈［4］。從2002年8月份起，國務院、國家最高法院等已開始禁止將抗生素菌渣用作飼料或飼料添加劑，禁止銷售不經(jīng)任何處理、簡單加工制成的生物有機肥，如何處理發(fā)酵廢渣成為亟待解決的問題。

目前國內(nèi)外對抗生素藥渣處理的研究主要集中在青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素等醫(yī)藥類抗生素產(chǎn)品上［5］，在城市生活廢水和工業(yè)廢水中殘留抗生素的治理方面研究報道較多，阿維菌素的研究主要集中在殘留檢測技術［6］和降解動態(tài)［7］方面。李榮等［8］從土壤中分離到一株能高效降解阿維菌素的菌株AW70，并將該菌株成功應用于南豐蜜桔中阿維菌素農(nóng)藥污染的修復。有關藥渣中殘留抗生素降解技術的研究及資源化利用方面還未見報道。

本研究從長期堆放的阿維菌素廢渣中篩選到可降解殘留阿維菌素的菌株AZ11，該菌株具有較高蛋白酶活性和耐高溫特性，可適用于阿維菌素發(fā)酵廢渣堆肥高溫腐熟，為阿維菌素發(fā)酵廢渣環(huán)保處理及其資源化利用提供科學依據(jù)，同時也為其它抗生素廢渣、廢水的綜合治理，提供可借鑒的新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養(yǎng)基

阿維菌素標準品購自浙江錢江生化股份有限公司，標樣用丙酮配成10 000 mg/L 的溶液。

基礎培養(yǎng)基:NH4Cl 1.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蛋白胨0.2 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.0。加入一定濃度的阿維菌素作為唯一碳源。

CMC 培養(yǎng)基:羧甲基纖維素10 g，K2HPO48.7 g，檸檬酸2.52 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L。

酪素培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，葡萄糖1 g，NaCl 5 g，CaCl20.1 g，L-Tyr 0.1 g，酪素5 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L。

1.2 樣品的采集

發(fā)酵廢渣樣品采自濟南澳利新型肥料有限公司，不同堆料部位(深度分別為0～20、20～60 、60～100 cm)取樣，每份取樣500 g。

1.3 菌株分離純化

取阿維菌素藥渣樣品10 g，加入90 mL 無菌水振蕩15 min 后，取1 mL 上清加入含阿維菌素50 mg/L 的基礎培養(yǎng)基中，分別置于35、45、55℃的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，3 d 為1 周期進行富集，共5 個周期，逐步提高阿維菌素濃度至200 mg/L。將培養(yǎng)液梯度稀釋涂布含阿維菌素的基礎培養(yǎng)基平板，并分別放置35、45、55℃恒溫箱中培養(yǎng)，挑選生長速度快的單菌落進一步分離純化，直至有單菌落出現(xiàn)。

1.4 高效降解菌的篩選

將分離的單菌落培養(yǎng)后定量接種到含阿維菌素100 mg/L 的基礎培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，設不接菌的處理為對照，每處理重復3 次。分別于接種后6、12、24、48、72 h 取培養(yǎng)液，4℃，10 000 r/min 離心5 min，取上清液2 mL，用HPLC 方法［9］測定阿維菌素含量，計算降解率。

1.5 高效降解菌株耐高溫能力測定

將待測菌株接種NA 培養(yǎng)基，分別置于40、50、60℃恒溫培養(yǎng)箱中，180 r/min 振蕩培養(yǎng)，36 h 后測定OD660。

1.6 高效降解菌株酶活測定方法

采用透明圈法檢測高效降解菌株的纖維素酶活性和蛋白酶活性［10］，分別挑取單菌落接種CMC 平板和酪素，培養(yǎng)48 h 后，觀察酪蛋白平板菌落周圍水解圈的產(chǎn)生情況，CMC 平板用1 mg/mL 剛果紅溶液染色20 min，然后用1 mol/L NaOH 退色20 min，并用清水沖洗干凈，在日光燈下觀察透明圈的大小。

1.7 高效降解菌株的分子生物學鑒定

菌株基因組DNA 提取參照《分子克隆實驗指南》［11］，采用CTAB/NaCl 法。利用16 s 通用引物A(5＇-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3＇)和引物B(5＇-TAC GGC TAC CTT GTT ACG-3＇)擴增16s rDNA。純化的PCR 產(chǎn)物由生Ⅰ生物工程(上海)股份公司測序，結(jié)果在Genbank 上利用BLAST 進行比對，利用DNAMAN 分析軟件進行比對并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 菌株對阿維菌素的降解特性

將高效降解菌株制成菌懸液，調(diào)整菌數(shù)為109cfu/mL，向基礎鹽培養(yǎng)基中添加終濃度為100 mg/L 的阿維菌素標準品，按體積比為1%接種菌懸液，然后分別置于40、50、60℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)，分別設無菌水對照，每個處理設4 次重復。于培養(yǎng)的第0、1、2、3、4 d 取樣測定發(fā)酵液中阿維菌素的含量。向基礎鹽培養(yǎng)基中添加不同濃度的阿維菌素標準溶液，測定培養(yǎng)3 d 后溶液OD660值，研究降解菌株對阿維菌素的耐受程度。

圖1 降解菌株耐高溫能力測定Fig.1 Thermostability determination of the degradation strain

2 結(jié)果與分析

2.1 阿維菌素降解菌株的分離

從阿維菌素藥渣樣品中通過富集培養(yǎng)，共分離到6株能以阿維菌素作為唯一碳源生長的細菌，其中AZ11和AZ12 培養(yǎng)72 h 后的降解率分別為77.6% 和75.3%。菌株AZ11 是從藥渣堆的85 cm 處的樣品中篩選得到的，取樣時該處溫度為52℃;AZ12 是從藥廠附近的土樣中篩選得到的。

2.2 降解菌株耐高溫能力測定

將篩選出的降解菌株進行不同溫度培養(yǎng)，36 h 后測定OD660，結(jié)果如圖1 所示，菌株AZ11 在50、60℃培養(yǎng)條件下的生長量明顯高于40℃，推測為高溫菌。另外兩菌株AZ12 和AZ16 的生長狀況則正好相反，在40℃下可以生長，但高于50℃時生長量明顯降低。

2.3 降解菌株纖維素酶、蛋白酶的活性測定

將分離純化獲得的降解菌株在CMC 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d 后，經(jīng)剛果紅染色，菌株AZ11、AZ12 均可以產(chǎn)生明顯水解圈(圖2)，說明具有一定的維素酶活力。接種酪素培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d 后，AZ11 在菌落周圍產(chǎn)生明顯的蛋白水解透明圈，水解圈直徑為9 mm(圖3)。

圖2 羧甲基纖維素平板活性檢測Fig.2 Detection of cellulase activity on the cellulose plate

圖3 菌株酪素平板活性檢測Fig.3 Detection of protease activity on casein plate

2.4 高效降解菌株AZ11 的分子生物學鑒定

利用16s 通用引物，擴增獲得AZ11 菌株的16s rDNA 序列共1 545 bp，經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將獲得的序列在GenBank 中進行Blast 比對，發(fā)現(xiàn)與芽孢桿菌屬的Geobacillus stearothermophilus 相似性達99.6%，將AZ11 鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。

2.5 高效降解菌株AZ11 對阿維菌素的降解特性

分別于降解菌接種后0、1、2、3、4 d 取樣，測定培養(yǎng)液中阿維菌素的濃度。從圖4 中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，降解菌對阿維菌素的降解率保持上升趨勢，在2～3 d 期間，菌株的降解率增長較快，3 d 后增長的趨勢相對平緩。對照阿維菌素水溶液(100 mg/L)在40、50 和60℃條件下也存在降解現(xiàn)象，4 d 降解率約為3.68%、6.25%和10.17%。

圖4 不同溫度下菌株AZ11 對阿維菌素的降解率Fig.4 Impact of different fermentation temperatures on abamectin degradation rate

圖5 不同濃度阿維菌素對菌株AZ11 生長的影響Fig.5 Impact of different concentrations abamectin on the strain growth

阿維菌素濃度低于800 mg/L 對菌株AZ11 的生長沒有明顯的影響，濃度大于800 mg/L 時開始影響AZ11 的生長，推測可能產(chǎn)生了高濃度中間代謝產(chǎn)物，抑制了菌株的代謝生長。在低于600 mg/L 時，對菌株生長影響不大，36 h 搖床培養(yǎng)發(fā)酵液菌數(shù)OD660維持在1.0 左右，表明該菌株適宜于環(huán)境中的高濃度阿維菌素殘留的降解。

3 討論

發(fā)酵工業(yè)副產(chǎn)物(藥渣)的處理問題是一個世界性的問題，限制藥渣資源化利用的主要“瓶頸”問題是其所殘留的抗生素。湯少紅等［12］將抗生素藥渣直接以肥料的形式用于花卉施用，也取得了較滿意的施肥效果，但藥渣中殘有抗生素，長期使用可能會對土壤微生態(tài)平衡產(chǎn)生負面影響。本項目從阿維菌素發(fā)酵藥渣堆肥中篩選到1 株能高效降解阿維菌素的菌株AZ11，經(jīng)測定該菌株具有明顯的纖維素酶和蛋白酶活性而且屬耐高溫菌株，通過分子生物學鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，該菌株在低于800 mg/L的阿維菌素濃度的培養(yǎng)基中可正常生長。該菌株可用于阿維菌素發(fā)酵廢渣固體堆肥中，通過降解阿維菌素殘留實現(xiàn)藥渣的資源化、無害化利用。

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