核桃油微乳液的制備及抗氧化活性研究

劉峰，催莉，耿巖玲，王曉，劉建華

(山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

核桃油為黃色或淡黃色油脂，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上［1］，其中以油酸、亞油酸、亞麻酸為主，是一種高級營養(yǎng)保健油。研究發(fā)現(xiàn)核桃油具有降血脂、降低心血管疾病發(fā)病風(fēng)險［2］，改善記憶力［3］，延緩衰老、清除自由基［4］，抗腫瘤［5］等生理活性。由于核桃油中不飽和脂肪酸含量較高，產(chǎn)品極易被氧化，同時，核桃油不溶于水，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。為克服上述不足，制備核桃油微膠囊是目前的主要手段［6-7］，但這些方法存在操作復(fù)雜，水溶液不穩(wěn)定等缺點，因此，開發(fā)工藝簡單、水介質(zhì)中穩(wěn)定的核桃油包封制劑，對于擴(kuò)展核桃油應(yīng)用領(lǐng)域有重要意義。

微乳液是透明或半透明的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，能增溶脂溶性或水溶性物質(zhì)［8］。該體系在食品、日用化工、化妝品以及石油工業(yè)等［9-12］方面有著廣泛的應(yīng)用。以表面活性劑為穩(wěn)定劑，制備核桃油微乳液還未見報道。

本文在原有亞麻酸微乳液研究的基礎(chǔ)上，以乙酸異戊酯為核桃油油相溶劑，選擇Tween 80 和EL-35 為表面活性劑，采用擬三元相圖法制備了穩(wěn)定的核桃油微乳液體系，研究了體系的相行為、熱穩(wěn)定性、微乳液粒徑和流變特性，并通過化學(xué)發(fā)光法測定了微乳液體系的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

核桃油，購自濟(jì)南市歷城區(qū)三川果品苗木專業(yè)合作社;聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(Tween80)、蓖麻油聚氧乙烯(35)醚(EL-35)，化學(xué)純(BASF Co.);魯米諾，鄰苯三酚，Na2CO3，NaHCO3，濃鹽酸，分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);水為二次蒸餾水。

ALV5000 動態(tài)光散射儀(Malvern Co.，德國);AR2000EX 流變儀(TA Co.，美國);MPI-B 型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司);DDS-II C 型數(shù)顯電導(dǎo)率儀(上海天達(dá)儀器有限公司)。

1.2 擬三元相圖的繪制

將核桃油與乙酸異戊酯按照質(zhì)量比1:1 配制成混合油相。清潔干燥的試管中，按照一定比例稱取定量的Tween 80，EL-35 為表面活性劑，混合油相，表面活性劑與油相的質(zhì)量比由10:0 逐漸變化到0:10，室溫下攪拌30 min，使其混合均勻。然后在攪拌下逐滴加水，觀察并記錄相態(tài)變化。記錄出現(xiàn)相變時的水含量，在相圖中標(biāo)出相應(yīng)的點，連接成曲線即得到相圖。

1.3 電導(dǎo)率測量

先配制一定比例的表面活性劑相和油相的混合物(7:3，8:2，9:1)，在25 ±1℃恒溫條件下攪拌均勻，逐滴加水，每次滴加后，充分?jǐn)嚢杓s5 min 再讀數(shù)，作出電導(dǎo)率隨加水量變化曲線。

1.4 粒徑及分散度測量

微乳液粒徑及多分散度是考察體系穩(wěn)定性及均一性的重要參數(shù)。通過測定不同濃度核桃油微乳液的粒徑，考察核桃油含量對體系的影響。

1.5 流變性質(zhì)測量

在相圖中選擇樣品點，配置樣品后，密封恒溫放置一周。在應(yīng)力控制流變儀上進(jìn)行流變性能測試。錐板直徑為40 mm，錐角為2°，板間距0.05 mm，測量溫度為25.0 (±0.1)℃。刮去椎板周圍擠出樣品(避免邊緣效應(yīng))后，開始測量。穩(wěn)態(tài)剪切實驗采用CR 模式。

1.6 O2- 清除率的測定

本實驗采用魯米諾-鄰苯三酚化學(xué)發(fā)光體系，以未添加核桃油的微乳液為空白，測定不同濃度的核桃油微乳液對O2-的清除率。以0.1 mol/L，pH 值10.2 的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制0.2 mmol/L 魯米諾溶液;采用10 mmol/L 的HCl 溶液配制10 mmol/L 鄰苯三酚溶液。在樣品池中依次加入魯米諾溶液4 mL、樣品(或空白)溶液0.2 mL、鄰苯三酚溶液0.4 mL，記錄其在400 s 內(nèi)的發(fā)光強(qiáng)度，以曲線積分面積表示相對發(fā)光強(qiáng)度，清除率計算公式如下:

其中，I0、I 分別為空白和核桃油微乳液樣品的相對發(fā)光強(qiáng)度。計算清除率在50%時的核桃油濃度IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃油微乳液相圖

圖1 是核桃油微乳液體系的擬三元相圖，其中，EL-35 與Tween 80 質(zhì)量比為8:2，核桃油與乙酸異戊酯質(zhì)量比為1:1。相圖內(nèi)可得到5 個相區(qū):其中2Φ 相為乳狀液;L2相為W/O 微乳液;LC 為液晶相;B.C.為雙連續(xù)相;O/W 相為O/W 微乳液，油相最大增溶量為9%。各相區(qū)的區(qū)分由電導(dǎo)率法和偏光顯微鏡法測得。

2.2 電導(dǎo)率法區(qū)分微乳液類型

電導(dǎo)率法是劃分微乳液類型的一個常用方法［13］。圖2 為油相與表面活性劑相質(zhì)量比2:8 時，體系電導(dǎo)率隨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的變化曲線。由于水在質(zhì)量分?jǐn)?shù)58% (b 點)之前體系為液晶相(由偏光顯微鏡觀察判斷)，因此，電導(dǎo)率測量由水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%時開始。隨著體系中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，電導(dǎo)率開始是非線性較緩慢的增加，這說明體系處于雙連續(xù)微乳結(jié)構(gòu)(B.C.)，當(dāng)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到73%(c 點)時，溶液的電導(dǎo)率達(dá)到最大值。隨著含水量的繼續(xù)增大，電導(dǎo)率下降，此時雙連續(xù)微乳結(jié)構(gòu)已全部轉(zhuǎn)變?yōu)樾〉挠偷畏稚⒅了橘|(zhì)中，形成O/W 型微乳液。含水量的增大使得微乳液滴的濃度降低，致使電導(dǎo)率下降。

同樣方法，測得其余油相與表面活性劑相質(zhì)量比的電導(dǎo)率變化，判斷體系B.C.與O/W 相，相區(qū)劃分如圖1 所示。

圖1 核桃油微乳液體系的擬三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of a walnut oli microemulsion system

2.3 溫度對微乳液的影響

隨著溫度的變化，微乳液可能會發(fā)生相轉(zhuǎn)變，因此測量體系在不同溫度下的穩(wěn)定性，對微乳液體系的應(yīng)用、儲藏有重要意義。微乳液樣品(B、C、D 各組分含量見表1)電導(dǎo)率隨溫度的變化，如圖3 所示。微乳液中導(dǎo)電粒子為O/W 型微乳液，溫度升高，微乳球之間的碰撞變頻繁，電導(dǎo)率上升。在實驗溫度范圍內(nèi)，微乳液體系澄清透明，無混濁生成，電導(dǎo)率基本呈線形上升，說明在此溫度范圍內(nèi)，微乳液類型保持不變。一般貨品應(yīng)用、儲藏溫度不會高于60℃，因此，該微乳液樣品在儲藏溫度范圍內(nèi)不會發(fā)生相轉(zhuǎn)變。

2.4 O/W 微乳液的粒徑及穩(wěn)定性

固定表面活性劑相(Saa)與水相的質(zhì)量比，考察體系O/W 微乳液的粒徑(Rh)及多分散度(PDI)隨油相加入的變化，通過動態(tài)光散射的方法進(jìn)行了表征，結(jié)果見表1。

表1 不同油相含量的微乳液粒徑及多分散度Table 1 Mean hydrodynamic diameter(Rh)and polydispersity index (PDI)of O/W microemulsions of different oil contents

如表1 所示，微乳液的粒徑隨油相的增加而明顯增大。這是因為樣品A 中無油相，僅僅是表面活性劑的膠束溶液，隨著油相的加入，表面活性劑單分子層變松，曲率變小，油相進(jìn)入膠束內(nèi)核或柵欄層，形成O/W 型微乳液，從而使粒徑增大。同時，微乳液體系多分散度也隨著油相的加入而增大，說明體系混亂度增加，在自發(fā)體系中，有的微乳液包封了較多油相，而有的則包封較少，致使粒徑分布不均。

2.5 微乳液流變特性

流變學(xué)的研究有助于了解溶液、溶膠等流體類型，對微乳液的應(yīng)用有重要意義。圖4(a)是微乳液樣品B、C、D 表觀粘度(η)在不同剪切速率(˙γ)下的變化曲線，樣品粘度表現(xiàn)為剪切變稀行為。中等剪切速率下，微乳液的流動曲線可用Ostwald de Waele 模型［14］(冪律模型):

式中K 為稠度系數(shù)，n 為流體特性指標(biāo)，表示與牛頓流體偏離的程度，n=1 時為牛頓流體，n ＜1 時為擬塑性流體。

對上述公式兩邊取對數(shù)，可得:

圖4 微乳液粘度隨剪切速率的變化Fig.4 Variation of microemulsion viscosity with the shear rate

表2 微乳液冪律模型中的n，K 值Table 2 n and K values for microemulsion samples

圖4(b)為微乳液lg η 隨lg ˙γ 的變化曲線，將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，可求得K，n 值，結(jié)果見表2。樣品中n都小于1，說明體系屬于擬塑性流體，剪切過程，可使流體組織排列更加有序，有利于延長或改善功能因子或藥物的緩釋時間。

2.6 核桃油微乳液對O2- 的清除作用

如圖5(a)所示，核桃油在微乳液體系內(nèi)對O-2有明顯的清除作用，清除率隨核桃油濃度的增加而增大，當(dāng)核桃油濃度為0.506 mg/mL時，清除率達(dá)到82.54%。同時，在微乳液體系中O-2清除率與核桃油的濃度在一定范圍內(nèi)(0.010～0.169 mg/mL)成線性關(guān)系，如圖5(b)。在此濃度范圍內(nèi)對清除率進(jìn)行線性擬合，得回歸方程y=19.360 +339.273x (R2=0.989)，IC50值為0.090 3 mg/mL。

圖5 核桃油微乳液對O2-的清除作用Fig.5 Scavenging activity of walnut oil microemulsion on superoxide anion

3 結(jié)論

通過擬三元相圖法，在無助表面活性劑的條件下，制備了核桃油O/W型微乳液。結(jié)果顯示，該微乳液具有良好的熱穩(wěn)定性;微乳液粒徑隨核桃油含量的增加而增大;穩(wěn)態(tài)剪切掃描顯示，微乳液剪切變稀，為擬塑性流體;核桃油在微乳液內(nèi)對O-2有較強(qiáng)的清除作用。本研究為核桃油功能性制劑的進(jìn)一步研究和開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。

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