重組溶葡萄球菌酶粉的抑殺菌效果試驗

文 / 陸 珉 錢春妹 張魯敬 解 虹 黃青山，2

（1 江蘇昆山博青生物科技有限公司 2上海復旦大學生命科學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室）

重組溶葡萄球菌酶粉是以重組溶葡萄球菌酶為原料，經低溫冷凍干燥而制成的單方制劑。本制劑作為抗菌藥，是通過裂解葡萄球菌細胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽鍵橋進而破壞細菌細胞壁的完整性，使其死亡，進而達到殺滅病原菌的目的。重組溶葡萄球菌酶粉一類新獸藥已經于2009年被農業部批準上市，目前已經在奶牛子宮內膜炎與乳房炎的預防和治療中得到廣泛應用，主要用于治療革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌或化膿隱秘桿菌等引起的牛急性和慢性子宮內膜炎，隱性乳房炎和臨床型乳房炎，并產生了良好的經濟效益和社會效益。但在成品檢測項目中，重組溶葡萄球菌酶粉并沒有體現其抑菌效果，為了能夠更清晰地表明重組溶葡萄球菌酶粉在奶牛體內的抑菌效果，本文在實驗室條件下，對其進行了藥物常規使用劑量稀釋后的抑菌率檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003）]、停乳鏈球菌（ATCC 35666）、無乳鏈球菌（ATCC 624）、化膿隱秘桿菌（ATCC 19411），以上菌種均來源于中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 藥物

重組溶葡萄球菌酶粉400 單位/瓶（批號：20120301）；重組溶葡萄球菌酶粉800 單位/瓶（批號：20120203），購于昆山博青生物科技有限公司。

1.1.3 培養基與試劑

細菌培養基（營養瓊脂培養基），購自國藥集團化學試劑有限公司；KF鏈球菌瓊脂培養基，購自上海研生生化試劑有限公司；血瓊脂培養基，購自上海酶聯生物科技有限公司；中和劑，自行配制，并鑒定合格，原料購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

雙人超凈臺（SW-CJ-2D），蘇州凈化設備有限公司；隔水式恒溫培養箱（GSP-9080MBE）和霉菌培養箱（MJX-160B-Z），上海博訊實業有限公司；移液器（200 μL、1 mL、5 mL）及配套的塑料吸頭，大龍興創實驗儀器有限公司；電動混勻器。

2 實驗步驟

2.1 細菌懸液制備程序[1]

2.1.1 培養基選擇。金黃色葡萄球菌選用營養瓊脂培養基，鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌）選用KF鏈球菌瓊脂培養基，化膿隱秘桿菌選用血瓊脂培養基。

2.1.2 金黃色葡萄球菌、鏈球菌（無乳鏈球菌和停乳鏈球菌）、化膿隱秘桿菌菌懸液制備。取第 3～6 代的培養了18～20 h的新鮮斜面培養物，用吸管吸取5.0 mL稀釋液（稀釋用TPS，即酸化水用生理鹽水）加入斜面試管內，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用吸管將洗液移至另一無菌試管中，用電動混勻器混合20 s，或在手掌上振打80 次，以使細菌懸浮均勻。

2.1.3 初步制成的菌懸液，先用細菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度，然后用稀釋液稀釋至所需濃度。

2.1.4 細菌繁殖體懸液應保存在4 ℃冰箱內備用。應當天使用不得過夜。

2.1.5 懷疑有污染時，應以菌落形態、革蘭氏染色與生化試驗等方法進行鑒定。

2.2 抑殺菌實驗

2.2.1 按照2.1配制實驗用菌懸液，使其濃度為 1×108～5×108CFU/mL。

2.2.2 藥物使用劑量

（1）重組溶葡萄球菌酶粉，每瓶為400 單位，分別取2 瓶，用無菌水稀釋至200 mL、500 mL及800 mL。

（2）重組溶葡萄球菌酶粉，每瓶為800 單位，分別取2 瓶，用無菌水稀釋至200 mL、500 mL及800 mL。

2.2.3 活菌培養計數

取4 mL重組溶葡萄球菌酶凍干粉稀釋液加入1 mL實驗用菌懸液，混勻，反應10 min后，取0.5 mL加入4.5 mL中和劑中，混勻，中和反應10 min。吸取 1.0 mL 樣液，按活菌培養計數方法測定存活菌數，每管樣液接種 2 個平皿。如平板上生長的菌落數較多時，可進行10 倍系列稀釋后，再進行活菌培養計數。

2.2.4 平行實驗

同時用無菌水代替凍干粉稀釋液，進行平行實驗，作為陽性對照。

2.3 重復實驗

重復抑殺菌實驗3 次，以保證結果的準確性。

3 實驗結果

3.1 重組溶葡萄球菌酶粉對金黃色葡萄球菌的抑殺菌實驗結果

從表1可以看出，不同規格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對金黃色葡萄球菌的抑殺菌能力都在88%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。

3.2 重組溶葡萄球菌酶粉對鏈球菌的抑殺菌實驗結果

從表2可以看出，不同規格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對鏈球菌的抑殺菌能力都在80%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。重組溶葡萄球菌酶粉對無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的抑殺菌效果無明顯差異。

3.3 重組溶葡萄球菌酶粉對化膿隱秘桿菌的抑殺菌實驗結果

不同規格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對化膿隱秘桿菌的抑殺菌能力都在80%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。

4 結論

實驗結果表明，重組溶葡萄球菌酶粉在常規的藥物劑量下，對金黃色葡萄球菌具有良好的抑殺菌效果，對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、化膿隱秘桿菌有一定的抑殺菌效果。

5 討論

重組溶葡萄球菌酶作為基因重組大腸桿菌表達的酶類生物制劑，主要通過溶解細菌細胞壁而殺死細菌，而非抑制細菌生長繁殖達到殺菌效力，是一種高效的生物殺菌劑[2]，特別是對有抗生素耐藥性的細菌有非常好的殺菌效果，且不會在動物體內殘留。以上這些優點使重組溶葡萄球菌酶成為一個新的研究熱點。

金黃色葡萄球菌、鏈球菌、化膿隱秘桿菌都是導致奶牛子宮內膜炎、乳腺炎的主要致病菌[3，6]，并且混合感染和單一感染同時存在，且混合感染率明顯高于單一感染率。在臨床上，重組溶葡萄球菌酶對革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌或化膿隱秘桿菌等引起的牛急性、慢性子宮內膜炎，隱性乳房炎和臨床型乳房炎有良好的療效。

表1 重組溶葡萄球菌酶粉對金黃色葡萄球菌的抑殺菌實驗結果

表2 重組溶葡萄球菌酶粉對鏈球菌的抑殺菌實驗結果

表3 重組溶葡萄球菌酶粉對化膿隱秘桿菌的抑殺菌實驗結果

重組溶葡萄球菌酶是通過生物發酵生產得到的，其生產過程具有安全、無污染、環保、無廢棄物、無輻射等優點。Robert J W的農業食品安全調查小組調查報告顯示[7]：現在仍沒有很有效的方法預防和治療由金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎。溶葡萄球菌酶是目前最有效的殺滅金黃色葡萄球菌的生物制劑。溶葡萄球菌酶在治療奶牛乳腺炎時的藥物殘留對動物和飲用牛奶的消費者無害；其在牛奶中有殺菌活性，并且不改變牛奶的物理、化學或營養成分；同時，由于乳酪和酸奶制品涉及到有益菌的培養，溶葡萄球菌酶在巴氏殺菌時可被滅活并且不影響正常的有益菌的培養過程。因此，用溶葡萄球菌酶治療哺乳期奶牛金黃色葡萄球菌菌感染是目前為止最有效、最安全的方法，而且對保護生態環境和生產綠色食品具有重要現實意義。

[1]衛生部衛生法制與監督司.消毒技術規范.北京：中華人民共和國衛生部，2002：15124

[2]Bastos， M.d.C.d.F.， B.G.Coutinho，M.L.V.Coelho.Lysostaphin： a staphylococcal bacteriolysin with potential clinical applications.Pharmaceuticals， 2010（3）：1139-1161.

[3]王國卿，王洪海，郭夢堯，等.奶牛產后急性子宮內膜炎病原的分離與鑒定.中國獸醫雜志，2010，46（10）：10-12.

[4]候振中，許微微.奶牛子宮內膜炎致病菌的分離與鑒定.東北農業大學學報，2008，39（12）：76-81.

[5]李玉，敖日格樂，王純潔，等.臨床型奶牛乳房炎致病菌的分離與鑒定.畜牧與獸醫，2011，43（3）：78-81.

[6]付連軍，尹柏雙，李偉，等.臨床型奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗.黑龍江畜牧獸醫，2012（10）：76-77.

[7]Robert J.Wall.By way of example.Biotechnological defence against mastitis diense.Agricultural outlook forum presentel.2006（2）：17.