hedgehog信號通路的負調控基因在早期非小細胞肺癌中的甲基化狀態及其意義

耿峻峰 孫晉楓 林強 顧峻 趙仰星 王韋 張紅宇 何英華 余堅

(1.上海交通大學附屬胸科醫院胸外科，上海 200030;2.復旦大學附屬中山醫院，上海 200032;3.上海交通大學醫學院仁濟醫院，上海市腫瘤研究所，癌基因及相關基因國家重點實驗室，上海 200032)

近年來，我國的肺癌發病率不斷升高，肺癌的病死率已躍居腫瘤死因之第一位［1］。85%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)［2］。NSCLC患者的預后主要取決于能否得到早期診斷和治療。據文獻［3］報道，ⅠA期 NSCLC患者的 5年生存率達73%，而ⅢA期NSCLC患者的5年生存率僅為25%。因此，尋找理想的NSCLC生物學標志物對NSCLC的早期診斷至關重要。目前，目標基因的甲基化狀態在腫瘤的早期診斷中已彰顯出優勢［4］。

hedgehog信號通路在腫瘤發生、發展中的作用越來越受到重視。我們研究了hedgehog信號通路的3個負調控基因:生長停頓特異蛋白1(growth arrest specific1，GAS1)、人類hedgehog相互作用蛋白(human hedgehog interacting protein，HHIP)和 patched1(PTCH1)在早期NSCLC患者肺癌組織中的甲基化狀態，探討它們在NSCLC早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用隨機數字表法選取2007—2011年上海交通大學附屬胸科醫院收治的Ⅰ期NSCLC患者85例(NSCLC組)，其中男性66例，女性19例;年齡32～79歲，平均(61.67±9.41)歲;其中鱗癌30例，腺癌51例，腺鱗癌4例。另選同期住院的23例非腫瘤性肺部疾病患者作為對照組，其中男性17例，女性6例;年齡42～75歲，平均(59.95±9.42)歲;其中肺結核5例，支氣管擴張3例，肺膿腫4例，遷延性肺炎2例，肺硬化性血管瘤3例，肺巨大淋巴結增生1例，肺錯構瘤2例，肺隔離癥1例，肺炎性假瘤2例。

1.2 細胞株 肺腺癌細胞株 A549(編號:CCL-185TM)、NSCLC細胞株 NCI-H1299(編號:CRL-5803 TM)以及肺大細胞癌細胞株NCI-H460(編號:HTB-177TM)均購自美國典型培養物保藏中心(A-merican Type Culture Collection，ATCC)，肺腺癌細胞株LTEP-a-2(編號:TCHu 33)及 SPC-A-1(編號:TCHu 53)均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

所有肺癌細胞株均采用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2(體積分數)、飽和濕度條件下培養。

1.3 方法

1.3.1 采用生物信息學方法分析hedgehog通路的負調控基因在NSCLC全基因組甲基化譜式數據庫中的甲基化狀況 本課題組前期采用Methylcap-seq方法建立了NSCLC及其癌旁組織的全基因組甲基化譜式數據庫，實驗方法見前期發表論文［5］。在本研究中，以該數據庫(信息未公開)信息為基礎，以10kb DNA長度為窗口顯示范圍，定位于hedgehog通路基因5’端啟動子區域的CpG島，以甲基化峰值高低作為判斷基因啟動子區域甲基化程度的標準，峰值高低與甲基化程度正相關。

1.3.2 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾 (1)提取基因組DNA后，取1 μg DNA，補水至終體積為20 μL;(2)加入3 mol/L氫氧化鈉溶液至質量終濃度為0.3 mol/L，混勻后在37℃環境放置20 min;(3)加入亞硫酸氫鈉230 μL后混勻，加石蠟油覆蓋液面，90℃環境放置30 min;(4)樣品脫鹽及磺酸根置換采用博大泰克生物科技有限公司生產的膠回收試劑盒，吸去石蠟油后，加入500 μL溶膠液，混勻后過柱，用漂洗液漂洗1次，然后加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液(含50%乙醇)300 μL，在室溫放置15 min，9000 r/min離心30 s，去除廢液，漂洗液漂洗2次;(5)用200 μL TE緩沖液洗脫后，保存于-20℃。

1.3.3 引物設計及合成 采用MethPrimer軟件進行引物設計，引物由上海賽百盛生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)方法 反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個循環;72℃完全延伸1 min。MSP結束后，將產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，并選擇有代表性的條帶割膠回收后，作T-A克隆并送上海杰李生物科技有限公司測序。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計數資料采用Fisher精確檢驗進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hedgehog通路的負調控基因在NSCLC全基因組甲基化譜式數據庫中的甲基化狀況 生物信息檢索結果顯示，與NSCLC癌旁組織相比，GAS1、HHIP和PTCH1在NSCLC癌組織中均呈不同程度的高甲基化狀態，見圖1。hedgehog負調控基因在NSCLC細胞株中的甲基化狀態，見表2。

表1 引物序列

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織的全基因甲基化組學數據庫中hedgehog信號通路負調控基因的甲基化狀態

表2 NSCLC細胞株中各基因的甲基化狀態

2.2 hedgehog負調控基因在NSCLC組及對照組中的甲基化狀態 2組部分患者DNA樣品的MSP產物的電泳情況見圖2。

統計分析顯示，GAS1、HHIP和 PTCH1在NSCLC組的甲基化率高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。這3個基因的甲基化檢測用于診斷臨床Ⅰ期NSCLC的敏感性和特異性見表3。

圖2 2組部分患者MSP產物的電泳圖

表3 GAS1、HHIP和PTCH1的甲基化檢測用于診斷Ⅰ期NSCLC的敏感性和特異性

3 討 論

hedgehog信號通路參與發育過程中許多生長及分化過程的調控，是進化中最保守的信號途徑之一，GAS1、HHIP和PTCH1是該信號通路中的3個負調控基因［6］。hedgehog信號通路的異常不僅與出生缺陷、肥胖等多種發育異常相關，而且與腫瘤的發生發展相關。hedgehog信號通路與腫瘤的關系最早在神經膠質瘤中被證實［7］，其后多項研究［8-10］表明，它與肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等許多腫瘤相關。

一般認為，腫瘤的發生主要是由于致癌因素造成DNA序列變異而致細胞生長、分化失控。近年來，隨著研究的深入，人們發現DNA序列改變以外的調控機制異常在腫瘤的發生、發展過程中更為普遍和重要，這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調控機制被稱為表觀遺傳學機制，包括組蛋白乙酰化、DNA甲基化、染色質重塑、microRNA以及非編碼長RNA的調控等，其中以DNA甲基化在腫瘤中的研究最為深入和廣泛。抑癌基因、DNA修復基因、細胞周期控制基因和抗凋亡基因等一些在正常細胞中處于低甲基化狀態的基因常被發現在腫瘤細胞中呈現異常高甲基化狀態而轉錄失活，據此考慮其參與了腫瘤的發生發展或導致腫瘤細胞生長失控。近年來，隨著DNA甲基化在基因層面、全基因組層面以及功能調控領域的廣泛研究，DNA甲基化在腫瘤診斷和治療中的應用越來越受到重視。

我們前期應用Methylcap-seq技術建立了NSCLC全基因組甲基化譜式。本研究我們在前期工作的基礎上采用生物信息學分析GAS1、HHIP和PTCH1的甲基化狀態，結果發現與癌旁正常組織相比，3個基因在NSCLC中呈異常甲基化。采用MSP方法進一步分析3個基因在肺癌細胞株基因組DNA中的甲基化狀態，結果發現，除在NCI-H1299中3個基因均呈去甲基化狀態以外，在其他4個腫瘤細胞株中均有1～2個基因呈甲基化狀態。隨后，對3個基因在85例臨床Ⅰ期NSCLC癌組織和23例非腫瘤肺部疾病組織中的甲基化狀態進行了檢測，結果顯示，3個基因在NSCLC組中的甲基化率與對照組差異有統計學意義，提示GAS1、HHIP和PTCH1在臨床Ⅰ期NSCLC中均表現為異常高甲基化。由此推斷，hedgehog信號通路中的這3個基因的異常高甲基化以及失活是NSCLC發生的早期事件。hedgehog信號通路的異常激活及其下游的一系列信號通路的異常可能是NSCLC發生發展的驅動因素。

綜上所述，GAS1、HHIP和 PTCH1在臨床Ⅰ期NSCLC肺癌組織中均存在顯著異常甲基化，這可能是hedgehog通路被異常激活的重要因素。對這3個基因在早期NSCLC患者血漿游離DNA中的甲基化狀態的進一步闡明，并進行大樣本量的臨床試驗，那么，這有望為NSCLC的早期診斷提供新的腫瘤分子生物學標志物。

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