嗜酸乳桿菌微膠囊制劑工藝初步研究

謝躍武，蘇振成，王 碩，孫 健，馬福海，毛大慶，*，張惠文

(1.沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016;2.森林與土壤生態國家重點實驗室，中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽110064)

微生態制劑是根據微生態學原理，通過調整微生態失調，保持微生態平衡，提高宿主的健康水平，利用對宿主有益的微生物或促進物質所制成的制劑。與抗生素相比，微生態制劑具有廣譜、非特異性抗菌殺菌作用［1］。目前，國內市場上有多種微生態制劑。其中，芽孢桿菌因能形成抗逆性強的芽孢而得到廣泛應用;乳酸菌益生效果良好，但不形成芽孢故抗逆性差、易失活而不適合生產應用。為了提高菌體的耐受性，延長微生態制劑貨架期，在菌劑制備過程中需進行膜包被或制成微膠囊［2］。然而，與國外微膠囊制備技術相比，國內相關技術仍不夠成熟。擠壓法是微膠囊技術中最常用的包被方法，其基本原理是將益生菌與親水性膠體混合，通過針或噴嘴擠出，逐滴滴入硬化液中，形成大小均勻的膠粒［3］。海藻酸鈉存在于褐藻中，是擠壓法常用的載體，它完全無毒，具有良好的生物相容性和成膜性。當海藻酸鈉遇到鈣離子時，鈉離子即被置換出來，生成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，此凝膠在pH＜6.0時不易溶解，在pH＞8.0時易溶解，符合動物腸溶性微膠囊制備的要求［4］。嗜酸乳桿菌具有緩解乳糖不耐癥、調整腸道菌群平衡、抑制腸道不良微生物的增殖、改善便秘、降低膽固醇和血氨、抗癌等作用［5］，本研究以嗜酸乳桿菌為實驗菌株，海藻酸鈉為載體，探索以擠壓法制備嗜酸乳桿菌微膠囊的最佳工藝，為工業化生產微生態制劑提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌種編號:1.2467);海藻酸鈉、氯化鈣、脫脂奶粉、谷氨酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、鈣黃綠素、酚酞、氫氧化鉀、EDTA;MRS液體培養基 胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖 20.0g，檸檬酸三銨 2.0g，MgSO4·2H2O 0.58g，K2HPO42.0g，乙酸鈉 5.0g，吐溫 80 1.0mL，MnSO4·4H2O 0.25g，蒸餾水 1.0L，pH6.2～6.4;破囊液0.2mol/L pH7.0PBS(5.01g Na2HPO4溶于70mL水取61mL，1.25g NaH2PO4溶于 40mL 取 39mL，混合121℃滅菌20min);人工胃液(pH1.2)取0.1mol/L HCl 16.4mL，加水約800mL，胃蛋白酶(活性3.000～3.500NFU/mg)10g，攪勻后加水定容至1000mL;人工腸液 9mL HCl加入1000mL水中，取出750mL再加入0.2mol/L的KH2PO4溶液250mL和胰酶(活性＞250u/mg)10g，調節 pH至6.8;所用試劑均為分析純。

ZDX－35SBI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;BCN－1360型生物潔凈工作臺 中國科學院武漢科學儀器廠;恒溫搖床 中科院武漢科學儀器廠;THZ－82B型氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫療器械廠;DPX－9052B－1型電熱恒溫培養箱 中國科學院武漢科學儀器廠;Nanodrop? 分光光度計 美國NanoDrop公司;高速離心機5415C 德國Eppendorf公司;Modulyod－230型真空冷凍干燥機 美國Thermo Savant公司;微膠囊發生器 實驗室自制，已申請專利。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化增殖 無菌開啟凍干保藏菌種，接入裝有MRS液體培養基的試管，37℃培養36h，活化3次。種子菌懸液以2%(V/V)接種量接入裝有MRS液體培養基的三角瓶中，37℃培養36h，菌液濃度為8.9×109cfu/g。

1.2.2 嗜酸乳桿菌微膠囊的制備 取一定量的菌液→離心(5000r/min，8min，4℃)→得濕菌體，加入脫脂奶粉、谷氨酸鈉混合液(乳化20min)→與海藻酸鈉溶液(無菌)混合，攪拌均勻→利用自制微膠囊發生裝置滴入氯化鈣溶液中，并以磁力攪拌器攪拌，400r/min→靜止固化(1h)→離心收集(350r/min，10min)→生理鹽水洗滌3次→冷凍干燥(－50℃，0.02Mpa，24h)→得嗜酸乳桿菌微膠囊［6］。

1.2.3 嗜酸乳桿菌存活率的測定 存活率(%)=凍干后微膠囊中的活菌數/包被前的總活菌數×100

凍干后微膠囊中的活菌數:取1g微膠囊溶于50mL 0.2mol/L PBS(pH7.0)中，振蕩0.5h后以稀釋平板計數法計數，將測得的活菌數乘以稀釋倍數再乘以溶液體積和凍干后微膠囊的質量即得凍干后微膠囊中的活菌數。包被前的總活菌數:確定海藻酸鈉、乳化劑、菌體的混合液體積，在滴入氯化鈣溶液之前取1mL以稀釋平板計數法計數，將測得的活菌數乘以稀釋倍數再乘以混合液體積即得包被前的總活菌數。

1.2.4 嗜酸乳桿菌微膠囊制備的單因素實驗 通過單因素實驗測定不同海藻酸鈉濃度(1%、2%、3%、4%)、氯化鈣濃度(1%、2%、3%、4%)、脫脂奶粉濃度(3%、4%、5%、6%)、谷氨酸鈉濃度(0.5%、1%、1.5%、2%)對嗜酸乳桿菌微膠囊存活率的影響。

1.2.5 嗜酸乳桿菌微膠囊制備的正交實驗 在單因素實驗基礎上，以海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、脫脂奶粉濃度、谷氨酸鈉濃度為研究對象，采用L9(34)正交實驗，以嗜酸乳桿菌的存活率為評價指標，選擇最佳配比。因素水平表見表1。

1.2.6 鈣離子濃度測定 配制海藻酸鈉、谷氨酸鈉、脫脂奶粉、菌泥混合液50mL滴入25mL 2%氯化鈣溶液中，每滴入10mL測一次鈣離子濃度。取1mL稀釋40倍，使其濃度接近500mg/L(該方法在水中鈣離子含量為500mg/L時，平行測定兩結果差不大于2mg/L)，經過濾，移入250mL錐形瓶中，加16.8%鹽酸3滴，混勻，加熱煮沸30s，冷卻至50℃以下，加5mL 20%氫氧化鉀溶液，再加80mg鈣黃綠素酚酞混合指示劑，用0.01mol/L EDTA標準溶液滴定至熒光黃綠色消失，出現紅色即為終點。水樣中鈣離子含量X(mg/L)，平行測量3次取平均值，按下式計算:

式中:V－滴定時EDTA標準溶液消耗體積，mL;M－EDTA標準溶液濃度，mol/L;VW－水樣體積，mL;110.98－氯化鈣摩爾質量，g/mol。

表1 正交實驗的因素和水平Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

1.2.7 嗜酸乳桿菌微膠囊的耐酸性實驗 取一定量未包被的菌體及微膠囊0.1g分別置于盛有50mL pH1.2人工胃液的三角燒瓶中37℃處理3h，每隔1h取樣測存活率。

1.2.8 微膠囊腸溶性實驗 取微膠囊0.1g置于盛有50mL pH6.8人工腸液的三角燒瓶中，37℃處理1h，每隔15min取樣，測溶液在305nm處的吸光度值。

1.2.9 微膠囊穩定性實驗 取冷凍干燥后的微膠囊在常溫下貯存60d，每隔15d取樣，測嗜酸乳桿菌存活率。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 海藻酸鈉濃度對嗜酸乳桿菌存活率的影響實驗選擇2%氯化鈣，4%脫脂奶粉，1%谷氨酸鈉，海藻酸鈉濃度為1%、2%、3%、4%條件下制備微膠囊，冷凍干燥后測菌體存活率，結果如圖1所示。隨著海藻酸鈉濃度的增加，存活率增大，但當濃度大于3%時，存活率下降，這是因為，當海藻酸鈉濃度過大時，體系粘度增大，阻塞針頭，不易于擠出，造成菌體損失。

圖1 海藻酸鈉濃度對存活率的影響Fig.1 Effect of concentration of sodium alginate on survival rate

2.1.2 氯化鈣濃度對嗜酸乳桿菌存活率的影響 實驗選擇2%海藻酸鈉，4%脫脂奶粉，1%谷氨酸鈉，氯化鈣濃度為1%、2%、3%、4%條件下制備微膠囊，冷凍干燥后測存活率，結果如圖2所示。隨著氯化鈣濃度的增加，存活率增加，原因是海藻酸鈉分子鏈上含有大量的羥基和羧基，用氯化鈣溶液作為交聯劑，可形成交聯的不溶于水的海藻酸鈣聚合物，提高凍干存活率。

圖2 氯化鈣濃度對存活率的影響Fig.2 Effect of concentration of calcium chloride on survival rate

2.1.3 脫脂奶粉濃度對嗜酸乳桿菌存活率的影響 實驗選擇2%海藻酸鈉，2%氯化鈣，1%谷氨酸鈉，脫脂奶粉濃度為3%、4%、5%、6%條件下制備微膠囊，冷凍干燥后測存活率，結果如圖3所示，當脫脂奶粉的濃度小于5%時，隨著脫脂奶粉濃度的增加存活率也增加，原因是乳清蛋白在細胞外形成保護膜并可以固定凍干的酶類，防止由于細胞壁損傷而引起的胞內物質泄漏。當達到6%時，存活率下降，可能是由于過多的脫脂奶粉造成溶液體系粘度增大，影響包埋效果，導致存活率下降。

圖3 脫脂奶粉濃度對存活率的影響Fig.3 Effect of concentration of skim milk powder on survival rate

2.1.4 谷氨酸鈉濃度對嗜酸乳桿菌存活率的影響實驗選擇2%海藻酸鈉，2%氯化鈣，4%脫脂奶粉，谷氨酸鈉濃度為0.5%、1%、1.5%、2%條件下制備微膠囊，冷凍干燥后測存活率，結果如圖4所示。當谷氨酸鈉濃度小于1.5%時，隨著谷氨酸鈉濃度的增加存活率也增加，這是因為谷氨酸鈉與糖類物質發生協同作用，增加干燥時基質的玻璃化轉化溫度，降低機械損傷的可能性，但當谷氨酸鈉濃度為2%時，存活率下降，可能是谷氨酸鈉與糖類物質玻璃化，體系粘度增大，不利于微膠囊擠出。

2.2 嗜酸乳桿菌微膠囊化的正交實驗

圖4 谷氨酸鈉濃度對存活率的影響Fig.4 Effect of concentration of sodium glutamate on survival rate

在單因素實驗結果的基礎上，以海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、脫脂奶粉濃度、谷氨酸鈉濃度為研究對象，采用L9(34)正交實驗，以嗜酸乳桿菌存活率為評價指標，選擇最佳配比。正交實驗結果見表2。由表可知，影響嗜酸乳桿菌存活率因素的主次順序是A(海藻酸鈉濃度)＞B(氯化鈣濃度)＞D(谷氨酸鈉濃度)＞C(脫脂奶粉濃度)。確定最佳工藝為A3B2C1D3，即海藻酸鈉濃度為3%，氯化鈣濃度為2%，脫脂奶粉濃度為4%，谷氨酸鈉濃度為1.5%。該工藝組合對應于表中的8號實驗，由表可知，在此配比下嗜酸乳桿菌存活率為99.21%。

表2 正交實驗結果Table 2 Result of orthogonal experiment

2.3 鈣離子濃度范圍的確定

如圖5所示，隨著海藻酸鈉混合液的滴入，鈣離子濃度逐漸降低，降至1.62%后，通過觀察發現微膠囊形態開始不均勻。擠壓法固化的原理是將海藻酸鈉滴入大量鈣離子中，海藻酸根與鈣離子結合，固化成海藻酸鈣。傳統的外源乳化法將少量海藻酸鈉滴入大量鈣離子中［7］，鈣離子濃度變化忽略不計，為使氯化鈣濃度隨海藻酸鈉混合液滴入而產生的變化更明顯，本實驗使海藻酸鈉混合液體積為氯化鈣溶液體積的2倍，測出微膠囊成囊效果最好的鈣離子濃度范圍。

2.4 嗜酸乳桿菌微膠囊耐酸性實驗結果

圖5 海藻酸鈉體積對鈣離子濃度的影響Fig.5 Effect of volume of sodium alginate on concentration of calcium chloride

如圖6所示，經微膠囊化的嗜酸乳桿菌在人工胃液中處理3h，仍有60.8%的存活率，而未經微膠囊化的嗜酸乳桿菌則不耐酸，在人工胃液里1h后就死亡殆盡。說明本實驗制備的微膠囊能夠耐受胃酸的破壞，具有耐酸性。

圖6 微膠囊人工胃液中的存活率Fig.6 The survival rate of microcapsule in artificial gastric juice

2.5 嗜酸乳桿菌微膠囊的腸溶性實驗結果

如圖7所示，305nm處的吸光度值在30min后基本穩定，且通過肉眼觀察可知，在人工腸液中處理30min后，溶液中已經基本不含固體顆粒，可以確定乳桿菌微膠囊在人工腸液中處理30min后已經完全崩解。說明本實驗制備的乳桿菌微膠囊具有較好的腸溶性。

圖7 微膠囊在人工腸液中的釋放結果Fig.7 The dissolved results of microcapsule in artificial intestine fluid

2.6 嗜酸乳桿菌微膠囊的穩定性實驗

如圖8所示，制備的嗜酸乳桿菌微膠囊在室溫存放過程中，其存活率下降緩慢，至60d時存活率為59.6%。而未進行微膠囊化的乳桿菌在室溫下貯存至15d時，其存活率便降到0。說明微膠囊包被能增強嗜酸乳桿菌在室溫下貯存的穩定性。

圖8 貯存時間對存活率的影響Fig.8 Effect of storage period on survival rate

3 結論與討論

擠壓法有兩點不足之處，首先，細胞在膠粒中分布不均，大部分集中在膠粒的空隙和表面，膠粒中心的細胞數量很少;其次，膠粒表面的細胞易釋放，不能阻隔胃液，產品不具備耐酸性［8］。本實驗將擠壓法與冷凍干燥結合提高微膠囊中活菌含量及耐酸性。谷氨酸鈉和脫脂奶粉是常用的乳酸菌冷凍干燥保護劑［9］。谷氨酸鈉分子量小，能透過細胞壁滲透到細胞內部，在干燥過程中可與海藻糖形成一種粘性玻璃態，因而分子擴散系數降低，蛋白質結構穩定，機械損傷減少從而起到保護作用，亦有利于延長貨架期［10］，且其效果優于乳糖，寧豫昌等［11］以乳糖為凍干保護劑制備的乳桿菌微膠囊貯存2個月后，乳桿菌存活率僅為30%，而本實驗制備的乳桿菌微膠囊貯存2個月后，乳桿菌存活率為59.6%。脫脂奶粉中的乳蛋白在菌體外形成保護層，可防止因細胞壁蛋白質損壞而引起的胞內物質泄漏［12］，但是如果濃度超過5%體系粘度過大則影響包埋效果。單因素實驗證明存活率與氯化鈣濃度成正比，但是當氯化鈣濃度過高時，微膠囊硬化過度不利于破壁，導致微生態制劑的腸溶性降低。

一般生產中將少量海藻酸鈉滴入大量鈣離子中，與鈣離子絡合形成凝膠聚集體海藻酸鈣［13］，鈣離子濃度的變化可以忽略不計，但造成了鈣離子的浪費。本實驗以EDTA滴定法測定鈣離子濃度，確定鈣離子濃度范圍在1.62%至2%時，成囊效果最好。工業化過程中可以保持海藻酸鈉等混合液的滴入速度一定，確定時間與鈣離子濃度的關系，定時補充氯化鈣。

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