復凝聚法制備山核桃油微膠囊的研究

王文瓊，包怡紅，王 芳，王 碩

(東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040)

山核桃(胡桃秋 Juglans mandshurica Maxim，又名核桃、核桃楸、楸子)產自黑龍江小興安嶺海拔500～800m以下，及東部山區、吉林、遼寧、內蒙古東部、河北、山西等地。山核桃油中含有多種人體必需脂肪酸，對降低人體血清蛋白中的膽固醇、防止動脈粥樣硬化和血栓的形成具有積極的作用，廣泛應用于食品、醫藥等領域［1］。而油脂易氧化變質，氧化后的油脂會產生不良風味，并引起機體的氧化，從而引發癌癥和人體衰老。另外，油脂的流動性差，給調料和湯料在包裝和食用時帶來很大不便。經微膠囊化處理后，可將油脂制成固體粉末油脂［2］。粉末油脂是采用特殊的手段，用一些成膜性的材料將油脂微滴包埋起來而形成的一種微膠囊化的固態粉末油脂，高效包埋的粉末油脂能夠避免油脂的氧化劣變、掩蓋特殊異味［2］。目前，在國際上已將微膠囊技術列入21世紀重點研究開發的高新技術之一，Chang等［3］以明膠和阿拉伯膠為壁材，樟腦油為芯材，制備微膠囊，包埋率達到99.6%。通過油溶性的聚苯乙烯，改善樟腦油微膠囊的緩釋效果。Weinbreck等［4］以乳清分離蛋白和陰離子多糖為壁材，通過復合凝聚法將風味油、維生素和藥物等微膠囊化。20世紀80年代末，我國也開始了在這一領域的研究與實踐，張韻等［5］選用殼聚糖聚陽離子及海藻酸鈉聚陰離子為壁材，在溶解有香蘭素的食物油表面形成多層包覆結構。真空冷凍干燥脫水獲得微膠囊成品。路宏波［6］以魚油為芯材，明膠和阿拉伯膠為壁材，以谷氨酞胺轉氨酶為固化劑，采用復合凝聚法制備魚油微膠囊，微膠囊化產率和效率分別達到94.79%和93.11%。本文以糖基化改性乳清分離蛋白和阿拉伯樹膠為壁材，采用復凝聚法，制備山核桃油微膠囊，即利用乳清分離蛋白與木糖的美拉德反應產物對山核桃油進行包埋。本研究為山核桃油制品工業生產朝著方便化、營養化和功能化方向發展，提供了取用方便、性質穩定且營養價值高的優質原料［7］。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

山核桃油 采自牡丹江經CO2超臨界萃取制得;乳清分離蛋白 美國;木糖 Sigma公司;阿拉伯樹膠 天津市東麗區麗昌化工有限公司;正己烷天津市富宇精細化工有限公司;冰醋酸、氫氧化鈉天津市東麗區天大化學試劑廠。

KQ－500DE數控超聲波清洗 昆山市超聲波儀器有限公司;JA2003型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;PHS－3CpH計 上海精密儀器有限公司;DHG－9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科科技有限公司;EMS－8型加熱定時數顯磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清分離蛋白的糖基化改性 將乳清蛋白和木糖按質量比2∶1比例溶解，制成60mg/mL的水溶液，采用氫氧化鈉調pH9，然后放入具塞試管中。并置于烘箱中，控制在50℃條件下進行反應，反應7d，即得乳清蛋白糖基復合物［8］。

1.2.2 山核桃油微膠囊的制備 利用改性乳清分離蛋白及阿拉伯樹膠所帶電荷相反的性質，讓其在芯材表面迅速絮凝成聚電解質膜，實現對芯材的包覆。將阿拉伯樹膠根據不同濃度要求，分別完全溶解在蒸餾水里。按設定比例，加入山核桃油，持續攪拌2h，使其成為乳狀液，將改性乳清分離蛋白溶液傾入乳狀液中，攪拌30min后，用20%冰乙酸溶液調節pH，繼續攪拌1h，再用20%氫氧化鈉溶液調pH，攪拌30min，最后加入轉谷氨酰胺酶固定化，冷凍干燥除去水分，得到產品。其基本流程為:

1.2.3 山核桃油微膠囊包油率測定

1.2.3.1 山核桃油微膠囊表面油含量的測定 參照徐滿清等［9］人的方法，略有修改。稱取1.00g的山核桃油微膠囊粉末，放入試管中，用20mL正己烷在輕微振動下浸提30s，立即用漏斗過濾，將濾液轉移至已恒重的試管(m1)中，然后在80℃下干燥箱中烘干至恒重(m2)。表面油含量為:M=m2－m1。

1.2.3.2 山核桃油微膠囊總油含量的測定 參照劉靈莉［10］的方法，略有修改。稱取1.00g微膠囊化山核桃油產品物放入試管中，加入20mL正己烷后進行超聲破碎，然后經4000r/min，10min離心，立即用漏斗過濾，將濾液轉移至已恒重的試管(n1)中，然后在80℃下干燥箱中烘干至恒重(n2)。表面油含量為:N=n2－n1，根據式(1)計算包油率:

1.2.4 山核桃油微膠囊制備工藝參數的確定 單因素實驗，以包油率為指標，依次考察阿拉伯樹膠添加量、山核桃油添加量、pH、改性乳清分離蛋白添加量和攪拌速度對山核桃油微膠囊包油率的影響，確定五因素四水平的最佳參數進行正交實驗分析，實驗設計的水平及因素見表1。

1.2.5 山核桃油微膠囊固化工藝參數的確定 單因素實驗，以包油率為指標，依次考察pH、轉谷氨酰胺酶添加量、固化時間、固化溫度對山核桃油微膠囊固化效果的影響，確定四因素三水平的最佳參數進行正交實驗分析，實驗設計的水平及因素見表2。

表1 制備山核桃油微膠囊正交因素水平表L16(45)Table 1 The factors and levels of L16(45)orthogonal experiment on preparation conditions of microcapsules of walnut oil

表2 山核桃油微膠囊固化正交因素水平L9(34)Table 2 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment on curing microcapsules of walnut oil

1.2.6 微膠囊貯藏實驗研究［11］將微膠囊化的山核桃油與未微膠囊化的山核桃油置于63℃培養箱中貯存，定期取樣測定樣品的過氧化值，比較二者的氧化速率。稱取2～3g樣品，置于具塞三角瓶中，加入30mL氯仿－冰乙酸(40mL氯仿+60mL冰乙酸)混合液，溶解樣品。加入1mL飽和碘化鉀溶液(10g碘化鉀+7g水)，立即加塞蓋嚴，振蕩搖勻，放置暗處5min。取出以上樣品，加水 100mL搖勻，然后以0.01mol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定，至淡黃色時，加入1mL淀粉指示劑(0.5g淀粉+50mL沸水)，繼續滴定直到藍色消失為終點。同時作空白實驗(除不加樣品外，其余相同)，樣品過氧化值按公式(2)。

式中:V－樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積(mL);V＇－試劑空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積(mL);N－硫代硫酸鈉標準溶液的濃度(mol/L);W－樣品質量(g)。

1.2.7 數據統計分析 數據統計分析采用SPSS11.5軟件，每個實驗重復3次，結果表示為平均值±偏差。畫圖采用Excel。正交實驗采用正交軟件V3.1進行設計及數據的處理。

2 結果與討論

2.1 山核桃油微膠囊的制備

2.1.1 阿拉伯樹膠添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響 改性乳清分離蛋白添加量為20mL，山核桃油添加量為0.8mL，pH4.5，攪拌速度為200r/min。分別考察阿拉伯樹膠添加量在 2%、4%、6%、8%、10%、12%對山核桃油包油率的影響。結果由圖1可知，隨著阿拉伯樹膠的濃度的增加，即乳化劑含量的增加，包油率逐漸升高，當阿拉伯樹膠的濃度達到8%時，包油率達到最大，當阿拉伯樹膠的濃度繼續增加時，包油率并沒有明顯升高。由此可以看出，阿拉伯樹膠的濃度過高并不會提高微膠囊的包油率，反而會造成壁材的大量浪費。在其他制備條件不變的情況下，阿拉伯樹膠的濃度為8%時，具有較好的包埋效果，使壁材能夠得到充分的利用［12］。

圖1 阿拉伯樹膠添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響Fig.1 The effect of gum arabic adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.2 山核桃油添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響 控制反應條件為:改性乳清分離蛋白添加量為20mL，阿拉伯樹膠添加量為8%，pH4.5，攪拌速度為200r/min。分別考察山核桃油添加量在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL對山核桃油包油率的影響。結果由圖2可知，在其他制備條件不變的情況下，隨著山核桃油添加量的增加，包油率逐漸上升，當添加量達到0.8mL時，包油率達到最大，當山核桃油添加量繼續增加時，包油率呈下降趨勢。即隨著山核桃油添加量的增加，反應所形成的微膠囊的數量也隨之增加，當山核桃油的添加量達到0.8mL時，可以達到芯材與壁材的充分利用［13］。

圖2 山核桃油添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響Fig.2 The effect of walnut oil adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.3 pH對山核桃油微膠囊包油率的影響 改性乳清分離蛋白添加量為20mL，阿拉伯樹膠添加量為8%，攪拌速度為200r/min。分別考察 pH3、3.5、4.0、4.5、自然(pH4.89左右)對山核桃油包油率的影響。結果如圖3所示。阿拉伯樹膠和改性乳清分離蛋白作為復凝聚微膠囊的壁材，具有獨特的功能特性，改性后的乳清分離蛋白表面仍具有大量的游離氨基，當在其等電點以下的溶液中時，改性乳清分離蛋白以帶正電荷的粒子存在。阿拉伯樹膠分子中含有羧酸，水溶液是帶負電荷的聚陰離子，所以它的存在形式不受pH的影響。因此，當pH低于改性乳清分離蛋白的等電點時，改性乳清分離蛋白以正電荷的形式存在，與帶負電荷的阿拉伯樹膠凝聚交聯。由圖3可知，隨pH的降低，山核桃油微膠囊的包油率呈現先上升后下降的趨勢，當pH4.5時，包油率達到最大，當pH繼續下降時，山核桃油的微膠囊包油率呈現明顯下降的趨勢。由此可以看出，山核桃油微膠囊溶液的pH對包油率的影響顯著，強酸性條件下會使已經形成的微膠囊壁材溶解，從而降低山核桃油微膠囊的形成。因此，微膠囊溶液的pH在4.5左右時，有利于山核桃油微膠囊的大量形成［14－15］。

圖3 pH對山核桃油微膠囊包油率的影響Fig.3 The effect of pH on microencapsulation of walnut oil

2.1.4 改性乳清分離蛋白添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響 阿拉伯樹膠添加量為8%，pH4.5，攪拌速度為200r/min。分別考察改性乳清分離蛋白添加量在5、10、15、20、25mL 對山核桃油包油率的影響。結果由圖4可以看出，在控制其他制備條件不變時，山核桃油微膠囊的包油率隨著改性乳清分離蛋白的添加量的增加而升高，當改性乳清分離蛋白的添加量達到20mL時，包油率達到最大，隨后繼續增加改性乳清分離蛋白的添加量時，包油率并沒有明顯升高。由此可以看出，增加改性乳清分離蛋白的添加量時，會增加阿拉伯樹膠與改性乳清分離蛋白復凝聚物的形成，從而提高山核桃油微膠囊成球的數量。

圖4 改性乳清分離蛋白添加量對山核桃油微膠囊包油率的影響Fig.4 The effect of modification whey protein isolate adding on microencapsulation of walnut oil

2.1.5 攪拌速度對山核桃油微膠囊包油率的影響改性乳清分離蛋白添加量為20mL，阿拉伯樹膠添加量為8%，pH4.5。分別考察攪拌速度在100、200、300、400、500r/min時對山核桃油包油率的影響。結果如圖5所示。攪拌速度是微膠囊形成的一個重要影響因素，直接影響微膠囊的包埋率和形態。攪拌速度既影響芯材和壁材的分散程度，同時攪拌速度對瞬間形成的微膠囊穩定性也有直接關系。由圖5可知，當攪拌速度為200r/min時，包油率最高，當攪拌速度為300、400r/min時，包油率都有所下降。由此可以看出，攪拌速度過慢，山核桃油和壁材之間不能充分混合，不能充分形成微膠囊，所以包油率也不高。當攪拌速度過快時，作用力過大，對形成的微膠囊造成破壞作用，而且會產生大量的氣泡，影響微膠囊的形成。

圖5 攪拌速度對山核桃油微膠囊包油率的影響Fig.5 The effect of stirring speed on microencapsulation of walnut oil

2.1.6 山核桃油微膠囊制備條件優化結果 由于因素與因素之間存在相互作用，根據以上單因素的結果，通過正交實驗來優化山核桃油微膠囊制備條件。優化結果見表2。

表2 山核桃油微膠囊制備條件正交實驗優化結果Table 2 The results of orthogonal experiment on preparation conditions of microcapsules of walnut oil

根據正交實驗分析的結果顯示，因素的主次順序為:攪拌速度(E)＞山核桃油添加量(B)＞改性乳清分離蛋白添加量(C)＞阿拉伯樹膠添加量(A)＞pH(D)。制備山核桃油微膠囊的最佳條件為A2B1C3D2E3，即攪拌速度為300r/min，山核桃油添加量為0.6mL，改性乳清分離蛋白添加量20mL，阿拉伯樹膠添加量為6%，pH4.5。但最佳制備條件不在正交實驗表中，故需要做進一步的驗證實驗。驗證實驗表明，在最佳制備條件下，山核桃油微膠囊包油率為82.18%。

2.2 山核桃油微膠囊的固化

2.2.1 pH對山核桃油微膠囊固化效果的影響 采用轉谷氨酰胺酶作為交聯劑，將凝聚反應結束后的微膠囊進行固化處理，酶濃度為15U/g阿拉伯樹膠，固化溫度為10℃，固化時間為6h，分別選擇 pH5、5.5、6.0、6.5、7.0來對山核桃油微膠囊進行固化，結果由圖6可知，固化過程中的pH對微膠囊的包油率影響較大，當pH為5.5時，包油率較低，即轉谷氨酰胺酶沒有較好的起到固化效果。當pH6時，山核桃油微膠囊固定化效果較好，包油率有所提高，可達83.34%。當pH為6.5和7.0時，微膠囊包油率有所下降，此時，不僅轉谷氨酰胺酶沒有起到較好的固定效果，而且會使部分已經凝聚的阿拉伯樹膠和改性乳清分離蛋白溶解，已經被包埋的山核桃油暴露出來［16］。因此，pH6時固化效果較好。

圖6 pH對山核桃油微膠囊固化效果的影響Fig.6 The effect of pH on curing microcapsules of walnut oil

2.2.2 轉谷氨酰胺酶添加量對山核桃油微膠囊固化效果的影響 固化溫度為10℃，固化時間為6h，pH6.0，分別選擇:酶濃度為 5、10、15、20、25U/g 阿拉伯樹膠來對山核桃油微膠囊進行固化。結果由圖7可知，轉谷氨酰胺酶的用量對微膠囊的固化具有一定的影響，隨著轉谷氨酰胺酶用量的增加，微膠囊的包油率逐漸增加，當酶用量為20U/g阿拉伯樹膠時，包油率達到最大，為83.65%，隨后增加酶的用量，包油率沒有明顯提高。因此，適宜的酶添加量不僅可以提高微膠囊的固化效果，而且可以節約成本。

圖7 轉谷氨酰胺酶添加量對山核桃油微膠囊固化效果的影響Fig.7 The effect of TG－H adding on curing microcapsules of walnut oil

2.2.3 固化溫度對山核桃油微膠囊固化效果的影響 固化時間為6h，pH6.0，酶濃度為20U/g阿拉伯樹膠，分別選擇:固化溫度為 5、10、15、20℃，來對山核桃油微膠囊進行固化。結果由圖8可以看出，當反應溫度為5℃時，微膠囊包油率較低，說明在5℃時，轉谷氨酰胺酶具有較低的交聯交聯微膠囊壁材的活性，當反應溫度為10℃時，微膠囊包油率升高，說明該溫度下，微膠囊壁材交聯效果良好;當溫度為15、20℃時，固化效果不明顯，包油率降低，因此，適宜的固化溫度會提高酶的活性，從而提高微膠囊包油率。

圖8 固化溫度對山核桃油微膠囊固化效果的影響Fig.8 The effect of temperature on curing microcapsules of walnut oil

2.2.4 固化時間值對山核桃油微膠囊固化效果的影響 固化溫度為10℃，pH6.0，酶濃度為20U/g，分別選擇:固化時間為 2、4、6、8、10h，來對山核桃油微膠囊進行固化。結果由圖9可知，固化時間對微膠囊包油率具有一定的影響，隨著固化時間的增加，微膠囊包油率增加，當固化時間為8h時，包油率達到最大，為83.90%。之后隨著時間的增加，包油率沒有提高。因此，固化時間太短，轉谷氨酰胺酶不能完全發揮作用，固化時間太長給生產帶來了浪費，選擇一個合適的時間對制備微膠囊來說具有很重要的意義。

圖9 固化時間值對山核桃油微膠囊固化效果的影響Fig.9 The effect of times on curing microcapsules of walnut oil

2.2.5 山核桃油微膠囊固化條件正交實驗 根據正交法優化固化山核桃油微膠囊條件的參數，綜合單因素實驗結果，確定pH(A)，轉谷氨酰胺酶添加量(B)，固化溫度(C)和固化時間(D)，運用正交軟件V3.1設計L9(34)正交實驗，對山核桃油微膠囊固化條件進行優化。正交優化結果見表4。

根據正交實驗分析的結果顯示，因素的主次順序為:pH(A)＞固化時間(D)＞固化溫度(C)＞轉谷氨酰胺酶添加量(B)。山核桃油微膠囊固化的最佳條件為A2B3C2D3，即固化pH為6.0，固化時間為10h，固化溫度為10℃，轉谷氨酰胺酶添加量為25U/g阿拉伯樹膠。但最佳固化條件不在正交實驗表中，故需要做進一步的驗證實驗。最佳固化條件A2B3C2D3下固化山核桃油微膠囊后的包油率為84.15%，經固化后微膠囊表面的蛋白交聯，形成穩定的剛性球結構，不易破裂。因此，包油率增加。

表4 山核桃油微膠囊固化條件正交實驗優化結果Table 4 The results of orthogonal experiment on curing microcapsules of walnut oil

2.3 微膠囊貯藏期間過氧化值變化情況分析

油脂的過氧化值是衡量脂肪酸酸敗程度的重要指標。結果由圖10可知，油和微膠囊置于63℃環境中，在初始階段過氧化值的變化都比較緩慢，但2d之后，未微膠囊化的山核桃油過氧化值急速增加，而山核桃油微膠囊的過氧化值增加速度仍較緩慢。分析其原因，可能是山核桃油微膠囊處于壁材膜的保護之下，油脂的氧化速度與氧氣透過壁材的速度有關，致密的微膠囊壁材結構能有效地阻止氧氣的滲透，另外也與改性乳清分離蛋白的抗氧化性能有關，所以山核桃油經微膠囊化處理可顯著地延長其保質期。但是5d以后，微膠囊化的山核桃油粉末也開始迅速氧化，可能是因為微膠囊的壁材在較高的溫度和長時間作用下原有的致密結構被打破，有部分油脂滲出，失去了微膠囊壁材的保護，油脂快速被氧化［17］。

圖10 貯藏期間過氧化值變化Fig.10 The change of peroxide value during storage

3 結論

3.1 本實驗所得的山核桃油微膠囊的最佳制備條件為:山核桃油添加量為0.6mL，改性乳清分離蛋白添加量20mL，阿拉伯樹膠添加量為6%，pH4.5，攪拌速度為300r/min。最佳固化條件為:固化pH 6.0，固化時間為10h，固化溫度為10℃，轉谷氨酰胺酶添加量為25U/g阿拉伯樹膠。最終包油率可達84.15%。

3.2 本實驗以改性乳清蛋分離蛋白和阿拉伯樹膠為壁材，轉谷氨酰胺酶為固化劑，對山核桃油微膠囊制備條件進行優化實驗，全過程采用低溫處理技術，極大限度地保留了山核桃油的營養價值。而且復凝聚形成的微膠囊經固化后，囊壁穩定，在高溫下不易解聚和破裂，復水后仍然能較好地保持微膠囊的原有狀態，能最大程度的減少芯材的損失［18］。另外，木糖和乳清分離蛋白美拉德反應后的糖基化產物具有較高的還原能力和體外抗氧化能力，作為一種新型的功能性壁材，為山核桃油微膠囊產品帶來較高的附加值，同時，也改變了傳統單一壁材包埋的缺陷性，更為乳清分離蛋白的開發利用開辟了新途徑。因此，新的功能性微膠囊壁材的開發利用，會給食品微膠囊工業帶來極大的革新和進步。

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