驢血清膽堿酯酶抑制法快速檢測蔬菜中農藥殘留

李穎暢，李作偉，呂艷芳，馬春穎

(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”，遼寧錦州121013)

近年來由于食用含農藥殘毒的蔬菜引起農藥中毒的事件時有發(fā)生，尤其有機磷農藥殘留較為常見。為了保障人們的健康和安全，各國都在加強對農藥施用的管理及加強對農藥殘留的監(jiān)測。氣相色譜、液相色譜等傳統儀器分析方法能有效檢測出蔬菜產品中的農藥殘留含量，但檢測成本高、耗時長［1－4］。為了防止因濫用農藥引起的有機磷類農藥的急性中毒，操作簡便、快速、靈敏度高的農殘測定法的研究亟待確立。酶抑制法的原理是將蔬菜等農產品的樣品提取液和膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)作用，然后在檢測體系加入底物和顯色劑，反應一段時間后，在特征波長測定吸光度的變化，計算膽堿酯酶的抑制率［5－6］，從而判斷農藥殘留情況。ChE 廣泛存在于動物的組織中，分為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰膽堿酯酶(bcetylcholinesterase，BChE)。目前對不同來源ChE的研究報道很多，該酶的實際應用有賴于廉價豐富的材料和酶的活性［7－8］。目前有人用馬血清丁酰膽堿酯酶、魚腦中的乙酰膽堿酯酶、小麥中的植物酯酶檢測蔬菜中的有機磷農藥，但存在膽堿酯酶提取手段繁瑣或材料不易得到等問題［6，9－10］。本實驗通過研究多種動物組織的ChE，發(fā)現驢血清BChE廉價易得，酶活性較高，易分離純化，且對有機磷化合物反應靈敏［9］。本文采用驢血清丁酰膽堿酯酶作為酶源，對不同的有機磷農藥的檢測條件和方法進行了研究，同時通過酶抑制法對錦州地區(qū)的部分蔬菜進行了農藥殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隨機抽取錦州市區(qū)3個農貿市場(以A、B、C表示)的蔬菜樣品，聚乙烯袋密封，2～4℃保存;新鮮驢血清 遼寧省朝陽市北票動物衛(wèi)生監(jiān)督所;碘化硫代丁酰膽堿、5，5＇－二硫代雙(2－硝基苯甲酸)(DTNB)Fluka公司;硫酸銨、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G－250、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國藥集團化學試劑有限公司;敵敵畏 湖北沙隆達股份有限公司;樂果 武漢鑫三角科技發(fā)展有限公司;敵百蟲 湖北省健源化工有限公司;高氯·馬拉硫磷 山東省聯合農藥工業(yè)有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)武漢化學試劑廠。

UV1600紫外－可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;HH－501型超級恒溫水浴鍋、HH－6型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;玻璃儀器氣流烘干器 鞏義市予華儀器有限責任公司;電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽堿酯酶的提取 血清中膽堿酯酶的提取參照劉暢等［7］的方法。

1.2.2 蛋白質含量的測定 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法［12］。考馬斯亮藍G－250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質結合后呈藍色。在一定濃度范圍內，溶液在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比，可用比色法測定。牛血清蛋白濃度與吸光度的標準曲線方程:Y=0.0004X+0.108(X:濃度，μg/mL;Y:吸光值)，R2=0.9993。通過標準曲線方程計算驢血清中蛋白質含量。

1.2.3 丁酰膽堿酯酶(BChE)活力的測定 參照文獻［7，13］的方法，略做修改。作為底物的碘化硫代丁酰膽堿被BChE分解為丁酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB反應，生成一種黃色絡合物，在波長410nm有吸收。以酶促反應的初速度來確定酶活力。取3mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH8.0)置于37℃水浴中，加入50μL酶提取液保溫 3min，然后依次加入 50μL 6.5mg/mL碘化硫代丁酰膽堿(BTChl)溶液，50μL 10mg/mL的DTNB溶液，充分混合，在波長410nm進行比色，記下吸光度的初始值，并記錄3min內吸光度變化值。

式中，U:酶活力，μmol/(min·mg);V:反應體系的總體積，mL;A:吸光度隨時間變化率，min－1;v:酶活測定時所取酶提取液的體積(μL);K:消光系數［L/(mmol·mm)］，1.36;C:蛋白質濃度，mg/mL;L:比色皿光程，10mm。

1.2.4 有機磷農藥濃度對抑制率的影響 將有機磷農藥用去離子水配成不同濃度的溶液，取50μL酶液分別與不同濃度的有機磷農藥在35℃保溫10min，然后依次加入底物、顯色劑DTNB，測其酶活力，以同時保溫的無農藥的酶液為對照，計算BChE殘留的酶活力。以農藥濃度的對數為橫坐標，BChE的抑制率為縱坐標，繪制有機磷農藥的抑制曲線。抑制率(I)的計算公式為:

式中，U0:未受抑制時BChE的活力;U1:受農藥抑制時BChE的活力。

1.2.5 抑制時間對抑制率的影響 在抑制溫度為35℃，5mmol/L 底物 50μL，酶液 50μL，0.1mg/mL 的有機磷農藥100μL條件下，考察抑制時間對抑制率的影響。抑制時間分別為 3、5、10、15、20、25min，測定每分鐘吸光度的變化值，計算抑制率。

1.2.6 檢測蔬菜中的農藥殘留 取5.0g剪碎的蔬菜樣品，加入10mL 0.2mol/L pH8.0磷酸緩沖液及50μL 1%的溴水，振搖10min后，取2.5mL上清液，直接加入50μL丁酰膽堿酯酶(BChE)液，抑制20min，然后加入100μL顯色劑DTNB、50μL碘化硫代丁酰膽堿溶液，搖勻后立即移入比色試管，用紫外—可見分光光度計測定。

1.3 統計分析

每個樣品至少做三個重復，采用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，實驗數據用ˉX±S表示。

2 結果與分析

2.1 有機磷農藥濃度對丁酰膽堿酯酶的抑制率的影響

據資料［7］報道，有機磷能與BChE的酯解部位的絲氨酸共價結合，形成磷酰化膽堿酯酶，此類復合體非常穩(wěn)定，膽堿酯酶酯鍵難以水解，不易使酶恢復原狀，從而降低酶促水解底物的能力。樂果、敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷對驢血清 BChE的 IC50分別為0.094、0.179、0.124、0.0078mg/mL;在相同濃度下，驢血清BChE對其靈敏度的大小順序為:馬拉硫磷＞樂果＞敵敵畏＞敵百蟲。

常見農藥的標準曲線方程如表1所示，標準曲線的相關系數都在0.98以上，能滿足蔬菜中農藥殘留檢測的要求。

圖1 有機磷農藥劑量與丁酰膽堿酯酶的抑制關系Fig.1 The inhibition relationship of organophosphorus pesticides dose and butyrylcholinesterase

2.2 抑制時間對丁酰膽堿酯酶抑制率的影響

從圖2可以看出，在一定時間范圍內，隨著抑制時間的延長，丁酰膽堿酯酶抑制率顯著(p＜0.05)增加，樂果、敵敵畏抑制時間大于15min以后，對酶抑制率的影響趨于平穩(wěn)，抑制時間為15、20min，抑制率無顯著性差異(p＞0.05)，因此選擇抑制時間為15min。敵敵畏、馬拉硫磷對丁酰膽堿酯酶的抑制時間超過20min后，抑制率無顯著性(p＞0.05)提高，因此抑制時間為20min。

表1 常見有機磷農藥的曲線方程和相關系數Table 1 Common organophosphorus pesticides curve equation and the correlation coefficient

圖2 抑制時間對丁酰膽堿酯酶的抑制率的影響Fig.2 The effect of time on inhibition rate of butyrylcholinesterase

2.3 硫代磷酸鹽類農藥的溴水氧化處理

硫代磷酸鹽類農藥(如馬拉硫磷、樂果等)經溴水氧化后，將此類農藥中的P=S氧化成P=O，能提高對酶的抑制率［14］。如表2所示，硫代磷酸鹽類農藥經溴水氧化后，能明顯增大對膽堿酯酶的抑制率，即提高檢測的靈敏度。

表2 硫代磷酸鹽類農藥用溴水處理前后酶抑制率的變化Table 2 The inhibition rate changes of the dithiophosphate pesticides with bromine water treatment

2.4 蔬菜中有機磷農藥檢測

根據國家標準(GB/T5009.199－2003)［15］，當被測樣品的抑制率小于50%時，結果為陰性，可判定樣品中無有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留;當被測樣品的抑制率大于50%時，結果為陽性，認為樣品中可能含有高劑量有機磷和氨基甲酸酯類農藥。

用酶抑制法檢測3個農貿市場的部分蔬菜樣品，結果見表3，韭菜有2例檢測結果超標，油菜有1例檢測結果超標，尖椒有2例檢測結果超標;蔬菜樣品合格率為86.1%。如果樣品中含有對酶有抑制作用的活性物質，可使BChE的抑制率偏高，產生假陽性結果;例如辣椒中的羥基或羰基上氫或氧可以破壞蛋白質二硫鍵和氫鍵使蛋白質變性，使乙酰膽堿酯酶失活［16］。如果樣品中含有較少的甲胺磷等農藥殘留，BChE對該農藥靈敏度較低，會產生假陰性結果。通過與氣相色譜測定方法比較，符合率在85%以上。

表3 遼寧錦州地區(qū)蔬菜中農藥殘留檢測結果(%)Table 3 The amount of pesticide residues in vegetables of Liaoning Jinzhou market(%)

3 結論

樂果、敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷對驢血清BChE的 IC50分別為 0.094、0.179、0.124、0.0078mg/mL，驢血清BChE對這4種有機磷農藥靈敏度的大小順序為:馬拉硫磷＞樂果＞敵敵畏＞敵百蟲。樂果、敵敵畏對膽堿酯酶最佳抑制時間為15min;敵百蟲、馬拉硫磷最佳抑制時間為20min。用酶抑制法檢測3個農貿市場的蔬菜樣品，發(fā)現韭菜有2例檢測結果超標，油菜有1例檢測結果超標，尖椒有2例檢測結果超標;蔬菜樣品合格率為86.1%。

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