RP－HPLC測定保加利亞乳桿菌腺苷酸方法的建立與應(yīng)用

孫茂成，李艾黎，霍貴成，孟祥晨，戚曉熙

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

保加利亞乳桿菌呈桿狀，一般呈長、大鏈，不運動，無芽孢，革蘭氏陽性，異養(yǎng)兼性厭氧型乳酸菌，是典型的酸奶發(fā)酵菌種之一［1－3］，它的代謝性質(zhì)直接影響酸奶的品質(zhì)，如口感、風(fēng)味和益生功能［4－7］等，解析其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝物組的變化已成為目前研究的熱點和難點。代謝組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展成為研究微生物代謝和代謝工程的有力工具，與基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)共同支撐起了系統(tǒng)生物學(xué)，為研究生物體完整的生命信息提供了代謝水平的支持［8－9］。淬滅是代謝組學(xué)研究中很重要的一個步驟，要求瞬間停止菌體的代謝反應(yīng)，從而獲得真實的菌體代謝片段［10］。60%(V/V)(－40℃)甲醇是使用最廣泛的淬滅液，可以亞秒級停止代謝反應(yīng)［11］。但是近來有文獻報道這種淬滅方法可以造成一些微生物胞內(nèi)代謝物的泄露，從而影響代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)真實性［12－13］。建立有效的淬滅手段已成為獲得真實代謝物組數(shù)據(jù)的必要條件。隨之而來，也就要求建立一個簡單快速準(zhǔn)確的方法來判斷淬滅液的淬滅效果。Faijes M［14］和 Hannes L［15］發(fā)現(xiàn)腺苷酸是個很好的鑒定淬滅液淬滅效果的指標(biāo)，ATP是胞內(nèi)代謝物泄露的良好指標(biāo)，能荷值(EC)可以指示菌體代謝反應(yīng)是否完全停止，正常生長的菌體細胞EC值在0.8～0.9之間;這兩位作者分別通過酶法和液質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)測定腺苷酸并成功地評價了淬滅液的淬滅效果，可見腺苷酸是個簡單準(zhǔn)確的淬滅評價指標(biāo)。但是傳統(tǒng)的酶法所需試劑昂貴、操作費時，現(xiàn)代的LC－MS法需要的設(shè)備價格不菲。高效液相色譜測定腺苷酸不失是一種快速、簡便、準(zhǔn)確和經(jīng)濟的方法，已廣 泛 應(yīng) 用 于 動 物 臟 器［16－20］、血 液［21］和 植 物 組織［22－24］內(nèi)腺苷酸的測定，但是應(yīng)用于微生物的腺苷酸的測定則鮮有報道。本研究目的是建立一種適用于保加利亞乳桿菌腺苷酸快速準(zhǔn)確檢測的高效液相色譜方法，從而為代謝組學(xué)的淬滅研究提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

保加利亞乳桿菌 KLDS 1.0204，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室分離保存;標(biāo)準(zhǔn)品5＇－三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP)、5＇－二磷酸腺苷二鈉鹽(ADP)、5＇－一磷酸腺苷二鈉鹽(AMP)Sigama 公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋;甲醇 色譜純;磷酸二氫鉀、氫氧化鈉 均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀 配備2487紫外檢測器和Empower色譜工作站，美國Waters;ALPHA 1－4 LSC冷凍干燥機 德國Christ。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 將保加利亞乳桿菌 KLDS 1.0204的種子培養(yǎng)液按3%接種于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期，取30mL發(fā)酵液，離心(7000 × g，5min，4℃)，菌體沉淀用生理鹽水洗兩次，5mL 60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液與菌體沉淀快速混合，離心(10000×g，5min，－20℃)，收集的上清液即為淬滅液，凍干后保存于－80℃。預(yù)熱至95℃的2mL去離子水迅速傾倒至菌體，沸水浴3min，冰浴上冷卻5min，離心(10000×g，5min，4℃)，收集的上清液即為胞內(nèi)提取物，凍干后保存于－80℃直至分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:SinoChrom ODS－BP C18(5μm，4.6mm ×250mm);流動相:甲醇－30mmol/L 磷酸鉀(pH7.0)緩沖液(V∶V=5∶95);紫外檢測波長254nm;柱溫25℃;流速0.7mL/min;進樣量20μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線的繪制 精密稱取一定量的ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相溶解并定容配制成濃度為100mg/L的儲備液。精密吸取儲備液，稀釋成 50、25、10、5、2.5mg/L，以峰面積為橫坐標(biāo)，腺苷酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇

將放置在－80℃中的樣品取出，用1mL流動相復(fù)溶，快速混勻后用0.45μm的濾膜過濾，立即進行色譜分析。這樣操作簡單，使得在樣品量較多的時候檢測更及時，避免待測物質(zhì)的降解。

2.2 流動相的選擇

2.2.1 磷酸鹽濃度的選擇 在柱溫25℃和流速1mL/min，比較 50、40、30、20mmol/L 的磷酸鹽濃度(pH6.5)對腺苷酸的分離效果。隨著磷酸鹽濃度的增加，ATP、ADP、AMP的保留值增大，但是鹽濃度過大對儀器及色譜柱的腐蝕性也大。當(dāng)磷酸鹽濃度降到20mmol/L，ATP受到干擾峰的影響。其它的磷酸鹽濃度均可以較好分離腺苷酸，但是應(yīng)該選擇低濃度且不影響腺苷酸分離效果的磷酸鹽濃度，故選擇磷酸鹽的濃度為30mmol/L。

2.2.2 甲醇濃度的選擇 磷酸鹽流動相不但會減少色譜柱的使用壽命而且容易堵塞色譜柱和色譜檢測器，在流動相中適當(dāng)添加有機溶劑會減少對色譜柱的傷害。在30mmol/L的磷酸鹽流動相(pH6.5)中分別添加5%、10%和15%的甲醇溶液，比較其對腺苷酸的分離效果的影響。實驗結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的增加，ATP和 ADP的分離度逐漸降低，添加10%甲醇時，ATP受到干擾峰的影響;添加15%甲醇時，ATP與 ADP分離不開。故本實驗采用在30mmol/L磷酸鹽流動相中添加5%甲醇溶液。

2.3 pH的選擇

腺苷酸在中性或弱酸性的條件下相對穩(wěn)定。采用1.2.2的色譜條件，比較流動相pH為7.0、6.5和5.5時對腺苷酸的分離效果。隨著pH的降低，ATP、ADP和AMP的保留時間逐漸提前，當(dāng)pH為5.5時，ATP與ATP的峰形開始出現(xiàn)拖尾;當(dāng)pH分別為7.0、6.5時，ATP和ADP的保留時間基本一致，只是AMP在pH為6.5時，保留時間明顯延后。故選取流動相的pH為7.0，在不影響腺苷酸分離效果的基礎(chǔ)上，可以對樣品進行快速分析檢測。

2.4 柱溫的選擇

對比柱溫為25和30℃對腺苷酸分離效果的影響。結(jié)果顯示柱溫為30℃時會導(dǎo)致AMP的峰形出現(xiàn)分叉，而柱溫為25℃時ATP、ADP和AMP的分離度和峰形均令人滿意。

2.5 流速的影響

設(shè)置柱溫25℃，分析流動相流速分別為0.5、0.7、1.0mL/min時對腺苷酸分離效果的影響。結(jié)果顯示流速的改變會直接影響色譜柱柱壓和腺苷酸的出峰時間。當(dāng)流速為0.7mL/min時，分析一個樣品僅在10min之內(nèi)，且色譜柱柱壓適中，故選擇流速為0.7mL/min。

2.6 腺苷酸的保留時間和線性范圍

取ATP、ADP和AMP的各自濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按照優(yōu)化好的色譜條件進行分析，根據(jù)各自腺苷酸的保留時間進行定性，腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相分離圖譜見圖1。

分別精密稱量ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相配制成各自濃度為100mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成50、25、10、5和2.5mg/L，共6個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別進樣20μL，以峰面積為橫坐標(biāo)，腺苷酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。直線回歸方程見表1。由此看出，質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9998。

2.7 精密度和回收率實驗

2.7.1 精密度實驗 取10mg/L的混合標(biāo)品，分別進行日內(nèi)和日間精密度測定，結(jié)果見表2，說明該法精密度良好。

圖1 腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分離圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of adenosine phosphates standards

表1 腺苷酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation coefficient of the adenosine phosphates

2.7.2 加標(biāo)回收率 在已知濃度的樣品中，分別加入高、中、低三種不同的腺苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法和條件測定其加樣回收率。結(jié)果如表3所示，ATP、AMP和 AMP的回收率分別為 94.12%～98.2%，102.5%～103.4%和108.2%～109.6%，RSD均小于3.3%，說明該法比較準(zhǔn)確可靠。

表2 腺苷酸測定的精密度實驗(n=5)Table 2 Precision of the measured results(n=5)

表3 樣品腺苷酸加樣回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 3 Recoveries of the measured results(n=3)

2.8 定量檢出限

定量限的確定是根據(jù)當(dāng)樣品峰的峰高與噪音峰的峰高的比值，即信噪比(RSN)，當(dāng)信噪比為10時的樣品濃度即為定量限。利用進樣流動相來確定空白的最大噪音峰的峰高，然后通過測定不斷稀釋ATP、ADP和AMP的標(biāo)品來確定定量限。ATP、ADP的定量限均為0.25mg/L，AMP的定量限為0.1mg/L。

2.9 評價冷甲醇淬滅保加利亞乳桿菌的效果

對淬滅液和胞內(nèi)提取物樣品按照上述優(yōu)化好的色譜條件進行分析，色譜圖見圖2、圖3。由表5可見，保加利亞乳桿菌在60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液淬滅時造成腺苷酸的大量泄漏，表明胞內(nèi)小分子物質(zhì)存在大量泄漏;菌體EC=(ATP+1/2 ADP)/(ATP+ADP+AMP)=0.42±0.015，不在正常生長的菌體細胞的0.8～0.9的范圍內(nèi)，表明菌體代謝反應(yīng)沒有完全停止，故該淬滅方案不適合保加利亞乳桿菌的代謝組學(xué)研究。雖然60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液是目前應(yīng)用最廣泛的，但并不是適用于每一種微生物。

圖2 胞內(nèi)提取物的腺苷酸色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of adenosine phosphates in cell extract

圖3 淬滅液的腺苷酸色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of adenosine phosphates in the supernatant of quenching fluid

表5 樣品中腺苷酸含量及胞內(nèi)代謝物泄露率(n=3)Table 5 The percentage of leaked adenosine phosphates in samples(n=3)

3 討論與結(jié)論

本研究中利用優(yōu)化的反相高效液相色譜方法，成功地對保加利亞乳桿菌在使用最廣泛的60%(V/V)甲醇/水(－40℃)淬滅后的淬滅液和胞內(nèi)提取物中的腺苷酸進行分離定量，從而反映其淬滅效果，該淬滅液造成的保加利亞乳桿菌腺苷酸的泄露情況與 Hannes L［15］利用 LC－MS 法評價 60%(V/V)甲醇/水(－40℃)淬滅大腸桿菌時造成的泄露情況基本一致，也進一步證明該色譜方法完全可以勝任對代謝組學(xué)研究中的淬滅效果的評價。此色譜方法的分離度、精密度、回收率和樣品分析時間均取得了令人滿意的效果，對今后保加利亞乳桿菌的代謝組學(xué)研究中的淬滅液篩選與評價提供了方法支持。

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