轉基因玉米Bt176品系特異性環介導等溫擴增檢測方法的研究

凌 莉，劉靜宇，易敏英，吳少云，劉 津，蔡 穎，李志勇，高東微，*

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州510623;2.華南理工大學，廣東廣州510640;3.汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭515031)

轉基因玉米品系Bt176是最早的轉基因作物品種之一，1995年由瑞士先正達公司研發，具有抗蟲特性。1995～2004年間，美國、加拿大、日本、荷蘭、歐盟、阿根廷、澳大利亞、南非、韓國、菲律賓和臺灣相繼批準了Bt176玉米作為食品或飼料的原料進行加工和銷售。我國于2004年批準Bt176玉米作為食品或飼料的原料進行加工和銷售。根據國務院《農業轉基因生物安全管理條例》［1］、農業部《農業轉基因生物進口安全管理辦法》［2］和國家質檢總局《進出境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》［3］等的轉基因管理政策，我國明確規定了轉基因產品申報和符合性檢驗管理制度，對進口農食產品中轉基因成分的品系鑒別檢測提出了技術要求。這為建立品系檢測方法和開展品系檢驗監管提供了法規依據。目前，國內現行轉基因玉米Bt176的品系特異性檢測方法標準有2項，分別是《SN/T 1196－2003玉米中轉基因成分定性 PCR 檢測方法》［4］和《NYB869HGG－8Y2007 轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性PCR方法》［5］。這2項標準均采用普通PCR結合瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的技術。國外普遍認可和采用基于TaqMan實時熒光PCR技術的歐盟官方檢測方法“Event－specific Method for the Quantification of Maize Bt176 Using Real－time PCR”［6］。我國轉基因監管檢驗的實際工作中，上述標準方法均存在一定的技術局限性，其中普通PCR是初篩檢測技術，操作繁瑣，容易發生交叉污染，且靈敏度較低;實時熒光PCR則需要依賴大型儀器設備，成本昂貴，難以在基層實驗室普及應用。因此，目前急需建立一種成本低廉、快速、簡便而且靈敏度高的檢測方法，滿足我國大宗糧谷和飼料進出口日常檢驗監管和快速通關的需要。環介導等溫擴增［7］(LAMP，Loop－mediated Isothermal Amplification)是在PCR基礎上發明的一種新型核酸片段擴增技術，具有高特異性、高靈敏度、操作簡便、結果判讀簡單和成本低廉的特點。目前LAMP檢測技術已在食品安全、生物安全、臨床醫學等領域得到廣泛的應用［8－12］，在轉基因領域也開展了對大豆、玉米等轉基因作物的快速檢測方法［13－16］，并已成為出口食品衛生微生物學檢驗的標準檢測方法之一［17］。本文通過優化反應參數和反應條件最終建立的轉基因玉米品系Bt176的品系特異性LAMP檢測方法靈敏、快速、操作簡便，是轉基因作物品系特異性檢測的一種有益補充手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米(M20、M21、M22、W7731、W5599、A155、A103、W7845、W8272)、玉米酒糟粕(YP1、YP10、W5544、W5545)、豆粕(262、118、313) 均來自于進出口商品;玉米 Bt176(5%)、大豆 GTS40－3－2(10%)均為IRMM?標準品;玉米MIR604(100%)、GA21(100%)、MON89034(100%)、大豆MON89788(100%)均為 AOCS?標準品;玉米MON810(10%)、98140(10%)、大 豆 DP356043(10%)、DP305423(10%)均為 ERM?標準品;Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒 北京盈田卓越科技有限公司;Ex Taq、dNTPs 寶生物工程(大連)有限公司;甜菜堿、Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol緩沖液 Sigma公司;1000×SYBR GreenⅠ 廈門百維信生物科技公司。

實時濁度儀LA－320C 日本LOOPAMP;NANODROP 1000核酸蛋白分析儀 美國THERMO SCIENTIFIC;ABI 7900實時熒光定量PCR儀 美國ABI;恒溫金屬浴 鄭州南北儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取與質量分析 按GB/T 19495.3－2004［18］規定，實驗樣品均采用CTAB法提取植物基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀測定DNA的純度和濃度后稀釋DNA溶液到100ng/μL，4℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成 根據玉米Bt176品系特異靶序列，采用LAMP專用引物設計軟件設計3套LAMP引物，由上海生工生物工程有限公司合成，純度為色譜級。

1.2.3 LAMP方法的建立 初步確定25μL的LAMP反應體系，其成分包括:1×ThermoPol緩沖液、外引物F3和 B3各 0.2μmol/L、內引物 FIP和 BIP各1.6μmol/L、環 狀 引 物 LF 和 LB 各 0.8μmol/L、1.4mmol/L dNTPs、0.8 mol/L 甜菜堿、6mmol/L MgSO4、0.32U/μL Bst DNA 聚合酶、DNA 模板200ng。

參照LAMP濁度儀使用說明書，將混合物置于反應孔中，在反應管中加入1滴石蠟油，管蓋內壁加入1μL 0.1%的SYBR GreenⅠ。然后將其置于65℃恒溫反應60min，最后80℃滅活5min結束反應。濁度儀實時觀察反應管中是否發生擴增，如果發生反應，產生焦磷酸鎂沉淀，濁度增加，濁度儀上會出現相應的峰段。反應結束后，將反應管蓋內壁的SYBR GreenⅠ離心，觀察反應管中液體顏色，進一步驗證是否發生擴增反應，如發生擴增，溶液為綠色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

1.2.4 LAMP引物的篩選 用5%的轉基因玉米Bt176標準品作為陽性對照，0%的轉基因玉米Bt176作為陰性對照，每組對照分別設置4個平行，進行LAMP反應。通過觀察實時濁度儀的峰圖結果，根據起始擴增時間、濁度變化和濁度曲線的重復性等指標對引物進行篩選。

1.2.5 LAMP反應體系和反應條件的優化 選取反應溫度61、63、65、67℃單個變量參數，進行單因素變化實驗，對LAMP反應條件進行優化。根據實時濁度儀觀察實驗結果，選擇最佳的反應體系和反應條件。

1.2.6 靈敏度實驗 為確定本方法的檢測靈敏度，采用不同梯度濃度(0%、0.1%、0.5%、1%、5%)的轉基因玉米Bt176標準品進行LAMP擴增，每個濃度設置2個平行，用實時濁度儀進行監測，并加入1000×SYBR Green I觀察顏色。

1.2.7 特異性實驗 采用轉基因玉米Bt176以外其他轉基因玉米品系的標準品、轉基因大豆標準品、含有Bt176的進口玉米商品和其他植物及其加工產品對本實驗設計的引物進行特異性實驗，用實時濁度儀監測結果，并加入1000×SYBR Green I觀察顏色。

1.2.8 穩定性實驗 用5%的轉基因玉米Bt176標準品的DNA添加到非轉基因玉米DNA中制成模擬樣品DNA進行檢測，添加量為5%、1%、0.5%、0%，每個模擬樣品DNA重復20次。

2 結果與討論

2.1 LAMP引物的篩選

根據玉米Bt176品系特異靶序列設計3套LAMP引物，用5%的轉基因玉米Bt176標準品作為模板進行引物的初步篩選，通過LAMP反應實時濁度儀結果顯示，第1、2套引物沒有發生擴增反應;第3套引物發生了擴增反應，出峰時間為37min左右，峰高為0.15，出峰時間和峰高值適中，可用于建立LAMP檢測方法，并應當進一步優化反應參數。

第3套引物的序列分別為:

外引物1(F3):TTAGGGACGTGGGTTTGGTCC;

外引物2(B3):GCGGAAGATCCGAGAAGAG;

內引物1(FIP):CCAATCAAGGCCATTGACCG AGATCTGATGTTCTCGAAT;

內引物2(BIP):GCCAAATCTCTCTCCCTCTCAT GTGGGAGGGAGCTTCTC;

環狀上游引物(LF):GGATTCGTGCATC AATAGG;

環狀下游引物(LB):TCCCCCTAAAGTCG ATACGAGGC。

2.2 LAMP反應體系和反應條件的優化

如圖2所示，在25μL反應體系中，當反應體系為MgSO4濃度為6mmol/L，甜菜堿 0.8mol/L、dNTPs 1.6mmol/L，反應條件為63℃恒溫反應60min，80℃滅活5min結束反應時，實時濁度儀顯示擴增結果的出峰時間為30min左右，峰高為0.18，出峰時間和峰高

圖1 第3套引物的擴增結果Fig.1 The amplification results of No.3 primers

圖2 LAMP反應體系和條件優化后的Bt176擴增效果Fig.2 The amplification results of Maize Bt176 after the LAMP reaction system and the parameters were optimized

2.3 靈敏度實驗

用0%、0.1%、0.5%、1%、5%的轉基因玉米Bt176標準品進行靈敏度實驗，顯色法結果見圖3，實時濁度儀結果見圖4。

實驗結果顯示，第3套的引物能從玉米樣品中檢出含量為0.5%的轉基因玉米品系Bt176，即靈敏度達到0.5%。

圖3 靈敏度實驗的LAMP顯色法檢測結果Fig.3 Specificity test of Bt176 LAMP assay(colour)

2.4 特異性實驗

實驗結果顯示，LAMP方法的引物特異性良好，可準確檢測出玉米Bt176的標準品、含有Bt176轉基因成分的冷凍玉米，其他樣品均沒有發生特異性擴增，檢測結果與歐盟采用的實時熒光PCR官方檢測方法的檢測結果一致，符合率達到100%。

圖4 靈敏度實驗的LAMP濁度法檢測結果Fig.4 Specificity test of Bt176 LAMP assay(turbidity)

2.5 穩定性實驗

在上述全部實驗中，LAMP實時濁度法和顯色法均得到穩定準確的結果，假陽性率和假陰性率均為0。

2.6 討論

2.6.1 方法的適用性 由于轉基因玉米Bt176品系已經退市，理論上正規進口的玉米和玉米制品中應當不再含有轉基因玉米Bt176成分。在本文的方法驗證過程中也確實遇到難以獲得含有該品系的商品的情況。不過，不能排除過去非法流入我國的轉基因玉米種植、留種、生產加工的可能性，以及轉基因玉米Bt176主要種植國家殘存儲糧的后續銷售。實際上，未經批準的轉基因玉米品系非法在我國大面積種植的報道時有發生［19－20］。為此，本文在為農食產品轉基因成分檢驗監管提供技術支撐方面仍然具有重要的現實意義。

考慮到方法驗證過程中缺少相關的實際樣品，特別是缺少玉米加工制品，本文提出，所建立的方法適用于檢測玉米原糧中轉基因玉米Bt176品系成分的檢測，不建議用于玉米加工制品的檢測。

2.6.2 兩種LAMP結果判斷方式的技術優劣LAMP的實時濁度法和顯色法兩種結果判讀方式都能準確判斷實驗結果。實時濁度法采用儀器設備實時記錄反應體系中的濁度變化，最主要的特點是可對實驗過程進行在線監控，與顯色法肉眼判斷相比記錄數據更加準確客觀。顯色法是終點判斷法，不需要依靠儀器，僅通過肉眼觀察顏色的變化判斷結果。因此，在方法建立和優化階段，采用濁度法能夠迅速有效地選擇適宜的參數和條件，對簡化研究工作有很大的好處。特別是對于引物的篩選，如果兩套引物都能夠發生特異性擴增，采用顯色法進行結果判斷會得到兩個相似的實驗結果，而采用濁度法則可以通過濁度曲線上出峰時間、峰高和曲線的平滑程度判斷出兩套引物的擴增效率，為引物的篩選提供了更加可靠的數據。與此同時，在方法的實際應用過程中，采用顯色法更為簡便，非常適合基層實驗室和現場檢測用途。

3 結論

本文建立的轉基因玉米Bt176品系特異性LAMP檢測方法能夠準確檢測出轉基因玉米Bt176成分，靈敏度達到0.5%，特異性和穩定性均達到100%。本方法實驗成本低廉、操作簡便、無需大型設備，在滿足我國大宗糧谷和飼料日常檢驗和快速通關需要的同時也是我國轉基因作物品系特異性檢測手段的一種有益補充。

［1］中華人民共和國國務院令第304號《農業轉基因生物安全管理條例》

［2］中華人民共和國農業部令第9號《農業轉基因生物進口安全管理辦法》

［3］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局令第62號《進出境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》

［4］SN/T 1196－2003，玉米中轉基因成分定性PCR檢測方法［S］.

［5］NYB869HGG－8Y2007，轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性PCR方法［S］.

［6］CRLVL08/04VP.Event－ specific Method for the Quantification of Maize Bt176 Using Real－time PCR［S］.

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