高效液相色譜－蒸發光散射測定瓜蔞中L－瓜氨酸的含量

李愛峰，柳仁民，張永清

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355;2.聊城大學化學化工學院，山東聊城252000)

瓜蔞為葫蘆科栝樓屬植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim.)和雙邊栝樓(Trichosanthes rosthorinii Harms)的干燥成熟果實，具有清熱滌痰、寬胸散結、潤燥滑腸之功效，用于治療肺熱咳嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛、結胸痞滿、乳癰、肺癰、腸癰、大便秘結等癥［1］。除了其重要的藥用價值，瓜蔞在保健食品［2］、日用化工［3］等領域也有廣泛的應用。L－瓜氨酸(L－citrulline)是首先從西瓜汁中發現的人體內非蛋白質氨基酸，廣泛存在于葫蘆科植物的果實中。L－瓜氨酸可以防治前列腺疾病、提高男性性功能，治療L－精氨酸缺乏引起的相關疾病，具有促進血液循環、保護心血管、改善微循環、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、增強免疫力、提高運動員肌肉力量與耐力及護膚去斑等重要作用［4］。目前，L－瓜氨酸的分析方法主要有氨基酸自動分析儀法、酶法［5］、比色法［6］、薄層掃描法［7］、高效液相色譜法［8］及質譜法［9］。在上述方法中，氨基酸分析儀法、酶法和質譜法價格昂貴，薄層掃描法和比色法的準確度、靈敏度都不高，而高效液相色譜法由于其分離效率高、分析速度快、準確度高等優點已成為氨基酸分析中最為有效的手段之一。由于L－瓜氨酸無紫外吸收，因此通常需要柱前衍生化處理，經常出現衍生物不穩定、步驟繁瑣、操作時間長、試劑毒性強等問題。蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一種新的通用型、質量型檢測器，特別適用于無紫外吸收的物質的檢測，已廣泛用于氨基酸的檢測［10－12］。本文建立了HPLC－ELSD法測定L－瓜氨酸的實驗方法，并用于實際樣品的測定，該法簡單、快速、準確、重現性好，為瓜蔞中L－瓜氨酸的定量分析提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L－瓜氨酸標準品 純度大于99.0%，美國Sigma公司;0.45μm微孔濾膜 浙江海寧市正興特種過濾設備制造有限公司;鹽酸為分析純 濟南試劑總廠;實驗用水為自制去離子水;瓜蔞藥材 購于當地藥店。

Unimicro HPLC泵及色譜工作站 通微(上海)分析技術有限公司;Attech ELSD2000ES蒸發光散射檢測器 美國奧泰公司;WK－1000A高速藥物粉碎機 青州市精誠機械有限公司;AR－1104的電子天平 奧克斯國際貿易上海有限公司;KQ3200型超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司。

1.2 色譜分離與檢測條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB－Aq柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm);流動相:水;流速:1.0mL/min;進樣量:20μL;柱溫:室溫;漂移管溫度:115℃;空氣流速:3.2L/min，分流閥狀態:關。

1.3 對照品溶液的制備

準確稱取L－瓜氨酸標準品100mg，用水溶解后定量轉移至100mL容量瓶中，加水定容，搖勻，該溶液作為標準儲備溶液。準確移取上述溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL容量瓶中，用水定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

精確稱取瓜蔞樣品適量，粉碎，以10倍量的鹽酸水溶液(10－4mol/L，pH4.0)超聲提取 3次，每次0.5h，過濾，合并提取液，經0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

由于L－瓜氨酸是水溶性氨基酸，因此首先以水為提取溶劑考察了不同的提取方法(冷浸、超聲及加熱回流提取)對于提取效率的影響，結果表明超聲提取的效率最高，而且具有提取時間短、操作簡便等優點。采用超聲提取法，考察了提取溶劑的pH(2.0、4.0、6.0、8.0)對于提取效率的影響，表明當pH為4.0時提取效率最高。這是由于L－瓜氨酸的等電點為pH5.97［13］，當提取溶劑的 pH 為 6.0 時，L－瓜氨酸的靜電荷幾乎為零，此時水溶性最差，提取效率亦最低，當提取溶劑的pH遠離等電點時，L－瓜氨酸以離子形式存在，水溶性增強，提取效率亦提高。而在堿性條件下，瓜蔞中的多糖類物質易發生糊化，增加過濾時的難度。此外，還考察了料液比、超聲時間及次數對于提取效率的影響，結果表明料液比為1∶10，超聲提取3次，每次0.5h即可提取完全。

2.2 色譜條件的選擇

為了選擇合適的色譜柱，實驗考察了L－瓜氨酸在普通 C18柱、C30柱、YMC ODS－A 柱及 Agilent ZORBAX SB－Aq柱上的保留情況，結果表明其在上述前三種色譜柱上幾乎沒有保留，保留時間僅為2min，而在Agilent ZORBAX SB－Aq柱上有較強的保留，可能是由于L－瓜氨酸的極性太強所致。使用Agilent ZORBAX SB－Aq柱，考察了流動相的組成對于分離效果的影響，結果表明甲醇或乙腈的比例越大，L－瓜氨酸的保留時間越短，與其他強極性物質之間的分離度越差，當以水作為流動相時，L－瓜氨酸與其他組分之間的分離效果良好，保留時間也令人滿意(如圖1所示)。

圖1 L－瓜氨酸對照品(A)及供試品溶液(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of L－citrulline reference substance(A)and the sample solution(B)

2.3 ELSD參數的選擇

漂移管的溫度和載氣的流速直接影響ELSD檢測器的響應，隨著漂移管的溫度升高，流動相蒸發趨于完全，噪音減小，信噪比提高，但溫度過高則會使流動相沸騰，噪音增大，甚至會導致組分部分汽化，響應值變小;載氣的流速越小，流動相蒸發后形成的溶質顆粒越大，散射光的強度越大，響應值越大，但流速太小會使流動相蒸發不完全，噪音增大，信噪比降低。分別改變漂移管的溫度和載氣的流速，觀察噪音和響應信號的大小，發現當漂移管的溫度為115℃，載氣的流速為3.2L/min，分流閥關時基線平穩，信噪比最高。

2.4 線性關系考察

分別取不同濃度的對照品溶液20μL進樣分析，由色譜工作站處理數據，以質量濃度(μg/mL)的對數為橫坐標，以峰面積的對數為縱坐標作圖，用最小二乘法進行線性回歸，得L－瓜氨酸的線性回歸方程和相關系數，并以信噪比等于3為標準，測得L－瓜氨酸的檢出限，列于表1中。

表1 L－瓜氨酸的回歸方程、線性范圍和檢出限Table 1 Regression equation，linear range and detection limit of L－citrulline

2.5 精密度實驗

取L－瓜氨酸對照品溶液，連續進樣5次，每次20μL，分別測定峰面積和保留時間，計算保留時間及峰面積的相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為0.27%和0.36%，表明該法精密度良好(見表2)。

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of precision test

2.6 穩定性實驗

取L－瓜氨酸對照品溶液，每隔4h進樣分析一次，連續進樣6次，每次20μL，分別測定峰面積和保留時間，計算峰面積及保留時間的 RSD分別為0.84%和0.23%，表明樣品在24h內穩定(見表3)。

表3 穩定性實驗結果Table 3 Results of stability test

2.7 回收率實驗

在已知L－瓜氨酸含量的瓜蔞樣品中加入一定量的標準品，按照1.4中的制備方法制備后進樣分析，平行測定5次，按照外標法定量并計算回收率，樣品加標回收率均為98.36%，RSD為1.77%，表明該方法準確可靠。

表4 回收率實驗結果Table 4 Results of recovery test

2.8 樣品測定結果

使用該方法對市售的瓜蔞樣品中L－瓜氨酸的含量進行了測定，結果見表5。

表5 樣品測定結果Table 5 Determination result of samples

3 結論

本文建立了HPLC－ELSD測定L－瓜氨酸的實驗方法，對實驗條件進行了優化，并進行了方法學考察，結果表明該法簡單、準確、快速、重現性好，適用于瓜蔞中L－瓜氨酸的含量測定，使用本方法對市售的四個不同產地瓜蔞樣品中L－瓜氨酸的含量進行了測定，結果表明其含量為0.1mg/g左右。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［s］.北京:化學工業出版社，2010:104.

［2］孫體健，王浩江，李秀花，等.栝樓黃色素的提取及性能研究［J］.中國食品衛生雜志，2005，17(3):228－231.

［3］常致成.脂肪酸酯的技術與市場發展動向［J］.日用化學品科學，2002，25(2):17－20.

［4］劉娟，路欣欣，孟慧.瓜氨酸的藥理作用及生產方法的研究進展［J］.藥學實踐雜志，2011，29(3):173－175.

［5］李加友，曹瑜，劉茜，等.酶法測定人尿中L－瓜氨酸含量［J］.分析化學，2006，34(3):379－381.

［6］錢嘉南，孫志浩，劉宇鵬，等.二乙酰一肟－氨基硫脲比色法測定酶轉化液中的L－瓜氨酸［J］.中國醫藥工業雜志，2007，38(7):519－522.

［7］岳瑞，歧琳，傅強.雙波長薄層掃描法測定天花粉中瓜氨酸的含量［J］.西北藥學雜志，2002，17(3):107－108.

［8］周慧，郝寧，嚴明，等.柱前衍生化HPLC法測定發酵液中L－瓜氨酸和L－鳥氨酸含量［J］.南京工業大學學報:自然科學版，2009，31(2):77－80.

［9］田國力，龔振華，王燕敏，等.非衍生化串聯質譜技術在氨基酸代謝障礙患兒診斷中的應用［J］.中國兒童保健雜志，2011，19(2):108－110.

［10］王玉紅，申克宇，李鵬，等.高效液相色譜－蒸發光散射檢測法直接檢測20種未衍生基本氨基酸［J］.色譜，2011，29(9):908－911.

［11］鄢丹，韓玉梅，董小萍.反相高效液相色譜－蒸發光散射檢測法同時測定阿膠中的17種未衍生氨基酸［J］.色譜，2006，24(4):359－362.

［12］王雅玲，代玲玲，馬堃，等.HPLC－ELSD法測定蛹蟲草中6種游離氨基酸的含量［J］.分析測試學報，2010，29(10):1091－1094.

［13］程志強，劉文革，鄧云，等.西瓜果實中L－瓜氨酸的提取與測定［J］.果樹學報，2010，27(4):650－654.