871家蠶膽固醇含量分析

谷留杰，高貴田，* ，段愛莉，孫翔宇，趙金梅，張義方

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062;2.安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725000;3.安康市蠶桑研究所，陜西安康725019)

膽固醇廣泛存在于動物體中，是動物細胞膜的重要成分，也是動物合成固醇類激素、維生素D的原料及膽汁酸的前體，是細胞多種生理活動所必需的。對于人體正常代謝，膽固醇也具有重要作用。但是，膽固醇攝入過量易導致血液膽固醇含量升高，進而誘發高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等眾多心腦血管疾病［1－2］?，F代醫學和營養學研究發現，食物中膽固醇的攝入量應不超過250～300mg/d人。目前膽固醇的測定方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、鄰苯二甲醛分光光度計比色法、薄層層析法及酶法等。與其它方法相比，高效液相色譜方法準確而快速。李黎等采用高效液相色譜法測定了食品中的膽固醇［3］，李杰等［4］采用高效液相色譜法快速測定了黑甜玉米油中的膽固醇。但目前為止家蠶中膽固醇含量的測定尚未見報道。家蠶(Bombyx mori)是公認的保健和滋補食療珍品，在漢代就有用家蠶控制糖尿病的記載。《齊民要術》、《本草綱目》也記載了家蠶食用和藥用功能［5］。不同蟲態的家蠶(卵、幼蟲、蛹、成蟲)均含有豐富的蛋白質、油脂、礦物質等營養物質。干蠶粉蛋白質含量為50%～55%，其中必需氨基酸占氨基酸總量的40%以上，且18種氨基酸的配比和必需氨基酸的含量均符合聯合國糧農/世界衛生組織(FAO/WHO)所規定的理想蛋白質模式［6］;干蠶蛹中油脂含量30%以上，其中不飽和脂肪酸含量占油脂總量的70%以上［7－8］。在中國、日本、泰國和其它亞太國家，蠶蛹作為常見膳食組分被廣泛食用［9－11］。目前，蠶蛹深加工發展迅速，已開發出全蠶粉［12－13］、蠶蛹罐頭［14］、復合氨基酸口服液［15］、蠶蛹精油、蠶蛹油軟膠囊、食品級蠶蛹蛋白粉、蠶蛹蛋白硬膠囊、雄蠶蛹蛋白硬膠囊［16－17］等功能性食品。迄今為止，對于家蠶不同發育階段、不同蟲態膽固醇含量未見報道。因此，本研究采用高效液相色譜法，測定871原種家蠶不同發育階段、不同蟲態膽固醇含量，為家蠶類食品的合理開發與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

家蠶 871原種，各蟲態(蠶卵、五齡幼蟲、蠶蛹、成蟲)及各發育階段家蠶均由安康市蠶桑研究所提供，蠶卵取3g，其它材料每次取20頭，稱鮮重后在80℃下烘至無水恒重，粉碎，備用;甲醇、無水乙醇 色譜純，天津市科密歐化學試劑公司;無水乙醚、石油醚和氫氧化鉀 分析純，天津市天利化學試劑公司;膽固醇標準品(純度99.7%)中國藥品制品鑒定所。

高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器 美國Waters公司;C18(5μm，250mm ×4.6mm)液相色譜柱美國迪馬公司;磁力攪拌加熱電熱套 上海雷磁新涇儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:C18(5μm，250mm×4.6mm);柱溫:38℃;流動相:甲醇;流速:1.0mL/min;紫外檢測波長:205nm。

1.2.2 標準溶液的制備 準確稱取膽固醇標準品50.00mg，溶于少量甲醇中，甲醇定容至50mL棕色容量瓶中，制得膽固醇儲備液(濃度1.0mg/mL)。吸取此溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL 置于 10mL 容量瓶中，甲醇定容，制成膽固醇標準使用液(濃度分別為為 0.100、0.200、0.300、0.400、0.500mg/mL)。

1.2.3 家蠶樣品前處理

1.2.3.1 皂化 稱取研磨均勻的樣品0.5000g于250mL平底燒瓶中，加入30mL無水乙醇，10mL 60%氫氧化鉀溶液，混勻后100℃磁力攪拌加熱回流1h。皂化結束后，用5mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內部，取下燒瓶冷卻至室溫。

1.2.3.2 提取 轉移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL蒸餾水洗滌燒瓶三次，再用40mL無水乙醇和石油醚(1∶1)沖洗三次，合并沖洗液與皂化液，振蕩2min，靜置分層。轉移水相于第二個250mL分液漏斗，再用30mL無水乙醇和石油醚(1∶1)提取兩次。合并三次提取液，倒入含有5.0g無水硫酸鈉的燒杯中，將上清液轉移到150mL圓底燒瓶中。

1.2.3.3 濃縮 將上述提取液在65℃下真空旋轉蒸發至干，乙醇淋洗定量至5mL，0.45mm微孔濾膜過濾，取20.0μL進行色譜測定。標準品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 標準品及樣品的膽固醇色譜圖Fig.1 Chromatogram of cholesterol standard and cholesterol in a sample

1.2.4 樣品檢測限測定 根據組分響應值的不同，在同一樣品中添加3種不同濃度的標準品，按1.2.3進行處理。待HPLC系統完全平衡后，以S/N＞3定為檢測限。

1.2.5 樣品加標回收率測定 在家蠶四種蟲態中分別添加3種不同濃度的標準品，并以1.2.3的方法進行處理(每個水平重復3次)，以衡量樣品前處理對目標組分的影響。

1.2.6 膽固醇含量計算公式 X=(C×V)/m

式中:X為樣品中膽固醇含量，mg/g;C為進樣樣品濃度，mg/mL;V為定容體積5.0mL;m為稱取樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

對膽固醇標準溶液進行全波長掃描后確定在205nm處有最大吸收峰，故選擇205nm為檢測波長。

2.2 標準品的分析

在1.2.1的色譜條件下，對5種不同濃度的標準品連續進樣3次，記錄標品的保留時間、峰高以及峰面積值。結果表明，組分保留時間、峰高以及峰面積的CV(n=3)均小于0.8%。由此可見，儀器和方法的穩定性均比較好。0.5000mg/mL膽固醇標準溶液色譜圖見圖1。

2.3 標準回歸方程

取1.2.2標準使用液，分別取20μL進行色譜測定，以峰面積Y為縱坐標，膽固醇濃度X為橫坐標繪制標準曲線。

方程為:Y=10585X+36833，R2=0.9989

可以看出，標準品的濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數r均在0.9900以上。因此，采用峰面積定量法對樣品中膽固醇進行定量分析是可行的。

表1 膽固醇回收率實驗結果Table 1 Results of recovery experiment of cholesterol

2.4 樣品檢測限的確定

采用1.2.4的方法測定家蠶樣品中膽固醇含量的檢測限為0.002mg/mL，完全符合國家檢測限標準的要求。

2.5 樣品加標回收率的測定結果

按1.2.5的方法，在家蠶4種不同蟲態中加入3種不同濃度膽固醇標品進行色譜分析，每個重復三次，以計算各組分的加標回收率，結果如表1所示?？梢钥闯觯倚Q的4種蟲態其加標回收率在89.1%～103.2%，平均回收率為 96.5%，相對標準偏差4.65%，在此色譜條件下以3倍信噪比計算檢出限測得本法檢出限為0.002mg/mL。因此，該色譜分析方法對于膽固醇的分析是準確、可信的。

2.6 家蠶不同蟲態膽固醇含量測定結果

分別測定蠶卵、幼蟲、蠶蛹、蠶蛾四種蟲態的膽固醇含量，每種蟲態重復三次，取平均值。參照鮮家蠶含水率為70%，計算出100g鮮蠶中膽固醇的含量，檢測結果見表2。方差分析表明家蠶不同蟲態膽固醇的含量之間差異性顯著。

表2 家蠶不同蟲態膽固醇含量Table 2 Determination of cholesterol in different instars of silkworm

表2表明，雌、雄家蠶在幼蟲、蛹期、成蟲三個時期膽固醇含量呈現明顯的增長趨勢，其中在蛹期時，雌、雄家蠶的膽固醇含量基本相等，而在幼蟲和成蟲期雌家蠶的膽固醇含量總是明顯高于雄家蠶。結果表明鮮家蠶不同蟲態中膽固醇的含量有所差異，即蠶卵(132.583mg/100g)＞成蟲(100.376mg/100g)＞蛹期(80.428mg/100g)＞幼蟲(55.105mg/100g)。

2.7 家蠶不同發育階段膽固醇含量測定結果

從五齡幼蟲期到成蟲期，每隔兩天測定一次家蠶在某一蟲態(幼蟲、蠶蛹、蠶蛾)下的膽固醇含量，重復三次，取平均值。參照鮮家蠶含水率為70%，計算出100g鮮蠶中膽固醇的含量，檢測結果見表3。

表3 家蠶不同發育階段膽固醇含量Table 3 Determination of cholesterol in different developmental stages of silkworm

圖2表明，雌蠶膽固醇含量在五齡幼蟲期的第6d最低(37.188mg/100g)，第8d最高(117.170mg/100g)，而雄蠶膽固醇含量在五齡幼蟲期的第8d最低(30.077mg/100g)，成蛾后第1d最高(91.698mg/100g);雌蠶膽固醇的含量在幼蟲期、成蟲期均高于雄蠶。在幼蟲期，雌蠶的膽固醇含量呈V型波動，且波動幅度大，雄蠶則一直緩慢下降。進入蛹期，雌蠶的膽固醇含量逐漸下降，雄蠶的膽固醇逐漸升高，然后它們均趨于平穩，在蛹期的最后幾天出現小幅度的波動。變成成蟲后雌蠶膽固醇升高，而雄蠶膽固醇降低。在昆蟲體內，膽固醇既是細胞膜的主要成分，又是蛻皮激素的前體物質，但其自身不能合成，只能從食物中攝取。家蠶從預蛹期開始便停止進食，即食物來源的膽固醇被切斷，那么從該階段往后到成蟲期膽固醇含量的變化就可能是家蠶體內其他物質轉化或分解成膽固醇所致。

表4 不同食品中膽固醇含量比較Table 4 Difference of cholesterol in various foods

圖2 家蠶不同發育階段膽固醇含量的變化Fig.2 Content of cholesterol in different developmental stages of silkworm

2.8 家蠶膽固醇含量與其他食品的比較

由表4可知，蠶蛹膽固醇含量明顯低于雞蛋、河蟹、墨 魚、炸 雞、雞 腿、豬 小 排、肥 牛 肉，為80.428mg/100g。

3 討論與結論

本文選取的材料871家蠶為中國系統，二化性品種，由57B交C4雜交選育而成，其與872的雜交品種在四川、山東、安徽、陜西、云南等省大量推廣應用。本文采用高效液相色譜法測定871家蠶不同蟲態中膽固醇含量，并對實驗檢測方法及結果的精密度、準確度進行了討論，測定效果比較理想。分析結果表明，871家蠶不同蟲態期膽固醇含量較低，其中蠶卵期的膽固醇含量最高。即蠶卵(132.583mg/100g)＞成蟲(100.376mg/100g)＞蛹期(80.428mg/100g)＞幼蟲(55.105mg/100g)。研究證實，昆蟲缺少膽固醇合成鯊烯合酶和羊毛甾醇合酶等兩種關鍵酶［18－20］，因此，其只能從食物中攝取膽固醇來滿足機體的正常生長、發育和繁殖的需要。但本研究顯示成蟲期膽固醇含量比蛹期含量高，但蛹期蠶未攝食，膽固醇來源尚需進一步研究。不同蟲態下雌雄家蠶膽固醇含量有一定差異，其原因也是本研究下一步進行的方向。

對871家蠶不同發育階段膽固醇含量研究后，發現其膽固醇含量的變化沒有明顯的規律，雌蠶和雄蠶的變化也不具有一致性，因此，我們推測膽固醇含量的變化是由多種因素共同作用所致。我們對實驗結果作出以下推測性的解釋:在第五齡幼蟲期的前6d，雌雄蠶膽固醇含量均逐漸降低，由于膽固醇是蛻皮激素的前體物質［21］，幼蟲化蛹時會合成大量的蛻皮激素，導致膽固醇消耗量增加。化蛹前，蠶不停地攝食，蛻皮激素合成量已滿足生理需要，不需要更多的膽固醇，所以膽固醇含量增加?；己蠹俺上x期膽固醇含量的變化暫不能做出合理的假設，有待進一步的研究。

通過對比其他食品中膽固醇含量，發現蠶蛹膽固醇含量明顯低于雞蛋、河蟹、墨魚、炸雞、雞腿、豬小排、肥牛肉［2］，蠶卵膽固醇含量為132.583mg/100g，低于雞蛋(585mg/100g)［2］。高膽固醇和飽和脂肪食物的大量攝取被認為是誘發高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素［1］，也有研究證明昆蟲體內膽固醇含量極低，是低膽固醇食品的潛在來源［13，22］。因此，高血壓、高血脂等心血管病患者及中老年人可以放心食用家蠶幼蟲、蠶蛹、成蟲食品及保健品。

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