原子力顯微鏡觀察DNA與內切酶的相互作用

李超英， 黃先愷， 楊光參， 王艷偉

(1．上饒師范學院物理與電子信息學院，江西上饒334001;2．溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江溫州325035)

0 引言

DNA與蛋白質分子的相互作用在許多生物過程中起著非常重要的作用，如DNA修復、復制與轉錄等［1-3］。DNA與蛋白相結合的精確位點的測定與觀察對于研究復雜細胞體系的機理與功能，特別是研究基因表達的控制十分關鍵［4-6］。限制性核酸內切酶根據酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子至少可分為四類。Ⅱ 型限制與修飾系統所占的比例最大，達93%。限制性內切酶在一定條件下能識別并切割特異的雙鏈DNA序列，但實際上內切酶與DNA的作用方式很多，這與內切酶、DNA的種類及緩沖液的條件等有一定關系。大多數內切酶與DNA的相互作用都需要二價鎂離子作為催化輔助因子。在鎂離子存在下，內切酶具有很大的切割活性，內切酶會識別4～8堿基對的特異的序列，然后會在該識別位點上或附近切割DNA［7-9］。在錳離子存在的條件，內切酶具有很小的切割活性;但在鈣離子存在的情況，內切酶沒有活性。原因是鈣離子可以模仿鎂離子產生特異性蛋白-金屬-DNA復合物，這種穩定的三元復合物阻礙內切酶對DNA的切割活性，反而增加結合性［10-11］。如EcoRV是一種小的內切酶，通過二聚體的形式與DNA發生作用，其識別序列是5’-GATATC-3’［12］。IIS 型內切酶BspMI識別不對稱的序列5’-ACCTGC-3，然后在該位點旁邊上下的第4與第8個堿基對處切割［13］。在溶液中，這種內切酶以四聚體形式存在，含有相同的子單元［14］。BspMI對DNA的切割一般先結合2個識別位點導致4個磷酸二脂鍵的斷裂，然后再與DNA分離，這與切割一個位點的內切酶不同［15］，所以，如果緩沖液中鈣離子代替鎂離子時，這種內切酶與DNA的結合會出現環狀結構［16］。

原子力顯微鏡(AFM)作為一種高度分辨率可達0．1 nm左右，寬度分辨率可達2 nm左右的表面分析儀器，已廣泛地使用于觀察各種DNA與蛋白質的相互作用，是研究這種作用最直接方便的操作方式［17-18］。本文用AFM研究內切酶EcoRV、BspMI與 λ-DNA的結合，內切酶EcoRV與λ-DNA有21個識別位點，內切酶BspMI與λ-DNA有41個識別位點，除了此結合位點外，也會有一些非特異性結合。由于作用方式的不同，結合的最終 AFM圖像明顯不同。本文主要用AFM對其不同作用方式的內切酶與DNA的結合給出直接的證據，說明其彎曲效果與成環結構。

1 AFM實驗原理

在AFM系統中，使用微小懸臂來感測針尖與樣品之間的相互作用，該作用力會使微懸臂擺動，當擺動發生時，會使照在懸臂末端的激光的反射光位置改變而造成偏移量，此時四象限激光檢測器會記錄此偏移量;然后把此時的信號傳給反饋系統，以利于系統做適當的調整;最后再將樣品的表面特性以影像的方式呈現出來。

AFM與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢能一般用Lennard-Jones勢能函數表示:

式中:r是勢能為0時兩原子的核間距;ε是勢阱深度，是勢能曲線上最低點勢能的絕對值。當懸臂尖端的原子與樣品靠近，開始時吸引力起主導作用;隨著距離的減小，兩者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡。當兩原子進一步靠近時，范德華力以斥力為主。

AFM的工作模式主要有:①“恒力”模式，是使用最廣泛的掃描方式，針尖與樣品間的作用力與距離有強烈的依賴關系，所以在掃描過程中利用反饋回路保持針尖與樣品之間的作用力恒定，即保持微懸臂的形變量不變，針尖就會隨樣品表面的起伏上下移動，記錄針尖上下運動的軌跡即可得到樣品表面形貌的信息，完成樣品掃描任務。②“恒高”模式，即在X，Y掃描過程中，不使用反饋回路，保持針尖與樣品之間的距離恒定，通過測量微懸臂Z方向的形變量來成像。這種方式通常在觀察原子、分子像時用得比較多，可以采用很高的速度，但對于表面起伏比較大的樣品不適用。

2 材料與方法

2．1 材 料

噬菌體λ-DNA(NEB公司)，用前不需要進一步純化。λ-DNA的原始濃度500 ng/μL，儲存液1×TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl與 1 mmol/L EDTA，pH 8．0)。限制性內切酶 EcoRV與 BspMI(Sigma-Aldrich公司)，其原始濃度是5 u/μL。分析純氯化鈣及其他的化學藥品(北京經科宏達公司)。實驗中用水都是超純水，經過密理博超純水系統過濾、去離子化處理。云母做成1 cm×1 cm的正方形，每次用前用透明膠新解離后使用，以保證云母片表面的平整度與清潔。

2．2 AFM 成像

AFM(日本京都島津公司，型號為SPM-9600)。所有的圖像都是在空氣中采用輕敲模式獲得。掃描速度3 Hz，均方振幅2 V，驅動頻率約350 kHz，硅探針具有固定的彈性系數42 N/m。圖片512×512像素。在AFM圖像中DNA高度、寬度等信息出SPM-9600自帶的離線分析軟件獲得。

2．3 AFM樣品準備

λ-DNA(500 ng/μL)的貯存液用含有10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl和 10 mmol/L CaCl2的緩沖液稀釋。DNA的最終濃度是1．25 ng/μL。接著把不同單位濃度的內切酶與DNA溶液混合，然后把混合液放到37℃的干式恒溫器內放置30 min，用移液器取出15μL的混合液放到剛解離的云母片上面，沉積2min后，每次用20μL的Milli-Q超純水沖洗云母片，約沖洗10～15次，目的是去除云母表面多余的DNA分子，最后立即用氮氣吹干待用。

3 結果與討論

本文用AFM研究了II型限制性內切酶EcoRV與λ-DNA的相互作用。一般情況下，內切酶對DNA有切割作用，但是用鎂離子代替緩沖液中的鈣離子后，內切酶的切割作用會被阻止。此時這種內切酶以二聚體形式綁定DNA的序列5’-GATATC-3’，會形成一個一個珠串狀結構，如圖1所示。在λ-DNA分子上面，這種序列出現過21次，隨著內切酶濃度的增加，DNA上面結合位點數也不斷增加，因此，如果每個位點都結合上內切酶的話，一根DNA上面應該有21個點。但是由圖2知，當內切酶濃度達到5 u/mL時，單根DNA上面結合位點的統計結果顯示不止有21個，可見在特異性結合的同時，也有一些非特異性結合。而且在圖1(C)黑色圓圈中明顯看出DNA上面內切酶結合的地方，DNA會發生彎曲，說明EcoRV對DNA還有扭轉彎曲的作用。

圖1 EcoRV與DNA相互作用的AFM圖像

圖3 是IIs型限制性內切酶BspMI與DNA的相互作用的AFM圖像，用鈣離子代替緩沖液中的鎂離子后，內切酶對DNA沒有切割作用，這種內切酶會以四聚體形式結合到DNA的單個序列5’-GAATTC-3’或綁定2個DNA的序列形成環狀結構。在λ-DNA分子上面，這種序列出現過41次。在實驗過程中，發現有些蛋白并沒有綁定2個DNA序列而形成環，而是會綁定到DNA的一個識別位點，如圖3(D)黑色圓圈所示。改變內切酶濃度，在云母片上面觀察BspMI-DNA的復合物，在圖3中可以看到，綁定單個位點或2個位點而形成環的兩種情況。當內切酶BspMI的濃度很高時，就會有更多的環狀形成。圖4為DNA上面內切酶的結合位點數量統計圖，隨著內切酶濃度的增加，綁定單個位點及2個位點形成環狀結構的數量都在增加，統計時把成環結構看成2個位點綁定進行統計。由圖4可知，內切酶濃度達到5 u/mL時，DNA上面的環狀結構很多，而且對單根DNA上面內切酶的結合數量進行統計也不止41個，說明也有非特異性的結合，而且發現內切酶的體積變大，可能發生內切酶之間的聚集。

圖2 EcoRV與DNA相互作用結合位點的統計圖

圖3 BspMI-DNA復合物的AFM圖像

圖4 BspMI與DNA相互作用結合位點的統計圖

圖5 是兩種內切酶與DNA作用的模型圖，能夠更直觀形象地說明其相互作用。在鈣離子緩沖液中，兩種內切酶與DNA結合作用是不同的。限制性內切酶EcoRV是二聚體的結構，與DNA的單個位點結合，并使DNA發生彎曲，形成珠串狀結構，如圖5(A)所示。BspMI是四聚體的結構，四聚體有2個識別位點，BspMI與DNA結合作用或結合一個位點形成珠串狀結構，或結合2個位點形成環狀結構，如圖5(B)所示。

圖5 兩種內切酶與DNA作用的模型圖

4 結語

本文利用AFM研究λ-DNA與內切酶蛋白的相互作用，主要對兩種內切酶與DNA的成像進行對比。該方法不僅可用于科學研究，還可引入近代物理實驗教學。該實驗的開設不僅可提高學生的動手操作能力，而且對生物學中重要的過程如DNA與內切酶的作用進行直接觀察，拓寬學生們對生物學與物理學結合領域的認識。

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