小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因功能分析

王 雷，姜廷波，張介馳

(1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150090;2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040;3.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010)

黑龍江省作為傳統(tǒng)的林業(yè)大省，經(jīng)過多年粗放式采伐經(jīng)營，不僅造成了森林可采資源匱乏，而且致使林木優(yōu)良種質(zhì)資源和林地土壤肥力嚴(yán)重退化。黑龍江省西部“三肇”、大慶、齊齊哈爾等地土壤鹽漬化和荒漠化程度不斷加重，這種惡劣的生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。目前，在黑龍江省西部林草植被恢復(fù)過程中，林木生產(chǎn)用品種不僅數(shù)量少，而且品質(zhì)差、產(chǎn)量低、抗逆性差。因此培育出抗逆的林木新品種，是解決上述問題的關(guān)鍵。林木由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、遺傳負(fù)荷大，許多重要性狀不僅分析困難，而且遺傳機(jī)理不明，從而造成了傳統(tǒng)的林木育種方法具有周期長(zhǎng)、見效慢、費(fèi)時(shí)費(fèi)工和優(yōu)良性狀基因的來源具有較大的局限性等缺點(diǎn)，因此利用常規(guī)方法選育耐鹽堿、優(yōu)質(zhì)、速生的林木品種難度大，所以至今尚未培養(yǎng)出真正耐鹽的林木品種。現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及在林木遺傳育種研究中的廣泛應(yīng)用，為在較短時(shí)間內(nèi)培育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和抗逆性強(qiáng)的林木新品種提供一條新的思路和方法。通過基因工程手段，可以得到大量的目的基因。按照中心法則遺傳信息的傳遞規(guī)律，最終影響生物體表型的是蛋白質(zhì)。如何獲悉這些基因翻譯成蛋白質(zhì)后的具體作用，就需要對(duì)它們進(jìn)行功能分析。從林木中克隆抗逆相關(guān)基因并研究這些基因的功能將為林木基因工程育種研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

小黑楊(Populus simonii×P.nigra)是小葉楊與歐洲黑楊的雜交種，1959年由中國林科院培育，現(xiàn)在在黃河流域及其以北的廣大地區(qū)均有栽植，是黑龍江省重要的防護(hù)樹種和用材樹種。小黑楊生長(zhǎng)快，輕度耐鹽堿，材質(zhì)細(xì)密，可用于造紙、民用建筑等。小黑楊的研究早期多集中于引種與栽培［1，2］，近些年關(guān)注的熱點(diǎn)多集中于利用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入外源基因提高小黑楊抗病性［3］、抗蟲性［4，5］和耐鹽性［6］的研究，而對(duì)小黑楊鹽應(yīng)答基因的研究卻很少。

環(huán)鋅指蛋白(ring zinc finger protein，RZF)最早由Lovering等［7］發(fā)現(xiàn)，它具有典型的C3HC4保守序列，保守區(qū)由40～60個(gè)氨基酸組成，富含半胱氨酸和組氨酸，可結(jié)合兩個(gè)鋅原子。由于此蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定，容易聚合，對(duì)其功能的研究尚不深入，初步研究表明，此蛋白可與其他蛋白相互作用，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白質(zhì)泛素化降解［8，9］。迄今人們已在水稻［10］和巴西橡膠樹［11］中克隆了 C3HC4型環(huán)鋅指蛋白基因。Zeba等［12］報(bào)道，大多非生物脅迫因素均可誘導(dǎo)甜椒環(huán)鋅指蛋白基因的表達(dá)，將甜椒中的C3HC4型環(huán)鋅指蛋白基因?qū)霟煵莺螅D(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。Schumann等［13］的研究表明，擬南芥中的一種C3HC4型環(huán)鋅指蛋白［14］在光呼吸的過程中也起作用。

本研究利用RACE技術(shù)克隆小黑楊環(huán)鋅指蛋白(Populus simonii× P.nigra ring zinc finger protein，PsnRZF)基因的全長(zhǎng)cDNA，進(jìn)一步研究該基因在根、莖、葉中的表達(dá)以及NaCl脅迫過程中的表達(dá)變化，將小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因構(gòu)建于植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，通過對(duì)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草表型及生理指標(biāo)的檢測(cè)，分析該基因的功能。本研究不僅為環(huán)鋅指蛋白基因功能的深入研究提供依據(jù)和參考，也為小黑楊基因工程育種研究奠定基礎(chǔ)。林木基因工程新品種對(duì)于提高我省西部干旱地區(qū)的林木覆蓋率，改善當(dāng)?shù)貒?yán)酷的生態(tài)環(huán)境，將產(chǎn)生不可估量的生態(tài)效益。林木基因工程新品種一旦進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，不僅具有廣闊的市場(chǎng)推廣前景，也必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)及環(huán)境效益。

1 材料與方法

將從溫室中取材的同一無性系小黑楊(Populus simonii×P.nigra)枝條進(jìn)行水培，于人工氣候室中培養(yǎng)，晝/夜溫度為26℃/22℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度175μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度約75%。生長(zhǎng)40 d左右，長(zhǎng)出新的根和葉片，將其分成兩組，一組作為對(duì)照于正常條件下培養(yǎng)，另一組用200 mmol/L NaCl進(jìn)行脅迫處理，分別在脅迫開始時(shí)(第0 天)和脅迫后的第1、2、4、6、8 天中取小黑楊的根、莖、葉，每組重復(fù)3次，用蒸餾水清洗，拭干后置于液氮中，于-70℃中保存?zhèn)溆谩煵萜贩N為SR-1(Nicotiana tabacum L.cv.Petit Havana SR-1)。

用SDS法［14］分別提取小黑楊根、莖、葉中的RNA，用SYBR Premix ExTaq試劑盒(購于大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR(Real-time PCR)［15，16］。以脅迫后第2天的小黑楊葉片RNA為模板，根據(jù)PsnRZF基因的序列信息(GW672596)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’/3’克隆，方法見5’/3’RACE Kit，2nd Generation(Roche)。將 PsnRZF 基因連接到植物表達(dá)載體pROKⅡ35S啟動(dòng)子后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化［17］，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行RT-PCR的檢測(cè)，分別檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因煙草在正常生長(zhǎng)和NaCl脅迫狀態(tài)下的 POD活性、SOD活性、MDA含量［18］，使用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定樣本葉綠素相對(duì)含量的變化情況。所得數(shù)據(jù)利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析 Duncan 檢驗(yàn)［19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

采用5’/3’RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法擴(kuò)增PsnRZF基因的5’/3’端，3’RACE得到一條630 bp的條帶(圖1)，5’RACE得到一條404 bp的片段(圖2)，經(jīng)電子拼接獲得帶有PolyA的全長(zhǎng)cDNA序列為1 061 bp。采用NCBI中的ORF程序顯示5’非翻譯區(qū)為184 bp，3’非翻譯區(qū)為82 bp，開放讀碼框?yàn)?95 bp，編碼264個(gè)氨基酸。用NCBI的保守功能區(qū)域(conserved domains)分析程序預(yù)測(cè)基因的保守區(qū)，結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物屬于環(huán)鋅指蛋白超家族，保守區(qū)位于第58～104氨基酸。

圖1 PsnRZF 3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 3’RACE product of PsnRZF cDNA M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1為3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 NaCl脅迫下小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因的表達(dá)分析

為研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因在鹽脅迫下的應(yīng)答，用Real-time PCR檢測(cè)NaCl脅迫前后PsnRZF基因在根、莖、葉中表達(dá)的結(jié)果(圖3)表明:在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，PsnRZF基因在根、莖、葉中均表達(dá)。在NaCl脅迫條件下，PsnRZF基因表達(dá)量在根、莖、葉中均升高，此基因在根中表達(dá)量變化并不顯著。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，PsnRZF基因在莖和葉中的表達(dá)量逐漸升高。此基因在葉中表達(dá)量的變化最為明顯，在脅迫后第2天和第4天顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，在脅迫后的第6天，此基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，極顯著地高于對(duì)照(P＜0.01)。脅迫后的第4、6、8天，PsnRZF基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。

圖2 PsnRZF 5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 5’RACE product of PsnRZF cDNA M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1為5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 NaCl脅迫下小黑楊PsnRZF基因在根莖葉中的表達(dá)Fig.3 The expression levels of PsnRZF gene in roots，stems and leaves under NaCl stress

小黑楊PsnRZF基因在不同器官中表達(dá)量變化存在差異，這可能是由于此基因編碼的環(huán)鋅指蛋白參與的很多生理反應(yīng)主要是在葉中進(jìn)行，如光呼吸，所以PsnRZF基因在葉中的表達(dá)量變化最為明顯。隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，PsnRZF基因的表達(dá)量也隨之升高，說明鹽脅迫影響了該基因的表達(dá)，PsnRZF可能在鹽脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。植物在逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)積累很多物質(zhì)，如信號(hào)分子ABA，有研究表明環(huán)鋅指蛋白可能參與ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)信號(hào)分子不斷積累，PsnRZF基因表達(dá)量升高，作為信號(hào)受體的PsnRZF數(shù)目增多，PsnRZF作為信號(hào)受體與信號(hào)分子互作，從而調(diào)控鹽應(yīng)答基因的表達(dá)。但小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)與哪類信號(hào)分子互作，以及這種互作調(diào)控哪些基因的表達(dá)都有待進(jìn)一步研究。

2.3 小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因功能驗(yàn)證

本研究利用正向遺傳學(xué)的方法來研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因(PsnRZF)的功能。將PsnRZF基因連接到植物表達(dá)載體pROKⅡ35S啟動(dòng)子后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，使其在煙草中過量表達(dá)，檢測(cè)過量表達(dá)的PsnRZF基因?qū)χ参锂a(chǎn)生的影響，從而確定其功能。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)已經(jīng)證明，PsnRZF基因已經(jīng)導(dǎo)入煙草中，并在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(圖4)。通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草并無差別。正常生長(zhǎng)條件下，多數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量低于非轉(zhuǎn)基因煙草(圖5)，轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量卻高于非轉(zhuǎn)基因煙草(圖6)。這說明在正常生長(zhǎng)條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)對(duì)植物體是有害的，這種傷害可能與氧化脅迫相關(guān)，導(dǎo)致膜脂的過氧化，因此轉(zhuǎn)基因植株MDA含量高于非轉(zhuǎn)基因植株。在鹽脅迫下，非轉(zhuǎn)基因植株SOD和POD活性迅速增強(qiáng)(圖7、8)，有效清除活性氧。但非轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量仍高于正常條件下的水平，說明鹽脅迫對(duì)非轉(zhuǎn)基因煙草膜脂造成了傷害;而鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量卻低于正常條件下的水平，這說明環(huán)鋅指蛋白對(duì)鹽脅迫下的膜脂氧化有一定的抑制作用或參與膜脂過氧化后的修復(fù)。鹽脅迫后，小黑楊環(huán)鋅指蛋白發(fā)揮了與正常生長(zhǎng)條件下不同的功能。環(huán)鋅指蛋白具有E3泛素連接酶的活性，在正常生長(zhǎng)與鹽脅迫下，環(huán)鋅指蛋白可能對(duì)不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化修飾，從而執(zhí)行不同功能［20］。

圖4 轉(zhuǎn)PsnRZF基因煙草的RT-PCR檢測(cè)Fig.4 RT-PCR detection of PsnRZF gene in transgenic tobacco

3 結(jié)論

克隆獲得小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因cDNA序列，全長(zhǎng)1 061bp，屬于環(huán)鋅指蛋白超家族基因。PsnRZF基因在不同器官中表達(dá)量變化存在差異，在葉中的表達(dá)量最高，其次為莖，在根中的表達(dá)量最低;在脅迫條件下，莖和葉中表達(dá)量呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的變化趨勢(shì)，而在根中，該基因表達(dá)量的變化不顯著。在正常生長(zhǎng)條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)可導(dǎo)致植物膜脂氧化程度增強(qiáng);但在鹽脅迫條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)可以緩解膜脂的過氧化作用。

圖5 NaCl脅迫對(duì)煙草葉綠素相對(duì)含量的影響Fig.5 Chlorophyll relative content of transgenic NaCl stress

圖6 NaCl脅迫對(duì)煙草MDA含量的影響Fig.6 MDA content of transgenic tobacco under tobacco under NaCl stress

圖7 NaCl脅迫對(duì)煙草SOD活性的影響Fig.7 SOD activity of transgenic tobacco NaCl stress

4 展望

本研究分析了PsnRZF基因的過量表達(dá)對(duì)植物的影響，在未來的工作中可以利用RNA干擾的方法使小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因沉默，觀察小黑楊的變化，從而進(jìn)一步研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因的功能，并且可以采用酵母雙雜交的方法確定不同生長(zhǎng)條件下環(huán)鋅指蛋白與何種蛋白發(fā)生互作。本研究中，植物表達(dá)載體上的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子，該通用型啟動(dòng)子有一定的局限性，在未來的育種研究中，建議將35S啟動(dòng)子替換成誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這樣可以更好地調(diào)控PsnRZF基因表達(dá)，提高小黑楊的抗逆性。

圖8 NaCl脅迫對(duì)煙草POD活性的影響Fig.8 POD activity of transgenic tobacco under under NaCl stress

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