枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HW201的酶學特性及漚麻試驗研究

于麗萍，郭立姝，殷 博，王笑庸，曹亞彬，陳立娟

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

脫膠是制約亞麻產業發展的主要瓶頸之一。現行的溫水漚麻方法存在著時間長、產量低、質量不穩定和污染嚴重等突出問題。針對這些問題，我國的科技工作者早在上世紀50年代就進行了相應的研究，先后開展了加化學助劑、立漚、水煮、太陽能、加稀土、充氣等新工藝研究，并取得了較好的結果，其中一些技術也曾應用于生產。在上世紀70年代，基于漚麻基本原理，亞麻快速生物脫膠技術開始出現，并隨亞麻紡織行業的興盛而快速發展。在此方面的研究中，中國農業科學院麻類研究所、齊齊哈爾大學、湖南農業大學、黑龍江大學、東北農業大學等單位先后進行了深入的研究，豐富了脫膠理論，開發了具有實際意義的應用技術。王立群等［1］使用枯草芽孢桿菌，使亞麻果膠含量降低到4.0% ～4.5%，出麻率提高30%，改善了纖維強度和外觀質量。彭源德等［2-3］研究的生物脫膠技術，其脫膠時間縮短70%以上，長麻率提高31%左右，纖維強度提高25.9%，BOD5和SS排放總量分別減少33%和89%以上。劉曉蘭、江潔等［4-5］利用費氏芽孢桿菌，使亞麻脫膠周期縮短30%，麻纖維質量有明顯改善。吳艷麗等［6］使用地衣芽孢桿菌進行快速脫膠，與對照相比，加菌漚麻液的果膠酶、木聚糖酶酶活均提高了50%以上，漚麻周期縮短了19% ～53%，減少了漚麻廢水對環境的污染。何連芳、孫玉梅等［7］采用優勢菌的脫膠周期比對照縮短50%左右，而且麻的纖維質量明顯得以改善。黃小龍、孫煥良等［8-11］系統研究了南方亞麻微生物脫膠的理論與技術，完善了亞麻脫膠的理論，技術在應用中取得了良好的效果。亞麻快速生物脫膠技術的使用，有效地解決現行脫膠技術中存在的諸多問題，突破產業化發展的瓶頸，促進行業發展壯大，對亞麻種植業、紡織加工業的發展有極為重要的推動作用。

1 材料與方法

1.1 基礎材料

亞麻原莖來自黑龍江省亞麻研究所，試劑為分析純。

1.2 培養基與培養方法

營養瓊脂培養基制備方法參考中國普通微生物菌種保藏管理中心主編“菌種目錄第三版”［12］。果膠—蛋白胨瓊脂平板的培養基組成:果膠 0.5% ～2.0%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂 1.5% ～2.0%。產酶液體培養基組成:亞麻原莖2.0% ～5.0%，硫酸銨0.1%。固體培養采用恒溫30℃靜止培養;液體產酶試驗采用30℃、120r/min搖床培養。

1.3 生理特性試驗

革蘭氏染色方法，芽孢染色方法，過氧化氫酶試驗，厭氧生長試驗，V.P反應及V.P反應后pH試驗，在疊氮化鈉(0.02%)中生長試驗，在氯化鈉7%中生長試驗，在pH5.7培養基中生長試驗，淀粉水解試驗，酪素水解試驗，酪氨酸水解試驗，馬尿酸水解試驗，丙酸鹽利用試驗，檸檬酸鹽利用試驗，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產酸試驗，利用葡萄糖產氣試驗。具體方法參見微生物學實驗手冊［13］中的描述。

1.4 酶活性的測定方法

蛋白酶測定采用福林法，測定環境其中堿性蛋白酶采用0.05M硼酸鹽緩沖劑(pH10)，中性蛋白酶采用0.02M磷酸鹽緩沖劑(pH7.5)，酸性蛋白酶采用0.1M乳酸鹽緩沖劑(pH3.5)。纖維素酶分別采用濾紙崩潰法與CMC糖化力法，測定環境采用0.02M磷酸鹽緩沖劑(pH7.5)。淀粉酶用碘檢查法測定，測定環境采用0.02M磷酸鹽緩沖劑(pH7.5)。果膠酶中果膠脂酶(PE)通過羧基釋放量測定，測定環境采用0.05M磷酸鹽緩沖劑(pH7.5);聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)通過不飽和糖醛酸釋放量測定，測定環境采用0.05M甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH9.0);內切聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)采用黏度法測定，測定環境為0.05M甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH9.0);外切聚半乳糖醛酸酶(exo-PG)通過還原力變化測定，0.05M甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)。酶活力具體方法依據《酶制劑工業》［14］中的描述進行。

1.5 PGL 基本性質

在35℃反應條件下，調整反應系統的pH，研究pH對PGL的影響。在pH7.0的條件下，調整反應溫度，研究溫度對PGL的影響。反應系統中分別加入1.0mmol/L的各種金屬離子，然后測定酶活力，以未加入為對照，研究金屬離子對 PGL的影響。酶液在0.05M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，在不同的溫度下保溫10min后，立即取樣測定剩余的酶活力，以Omin處理為對照，研究PGL的溫度穩定性。

1.6 漚麻基本條件

亞麻原莖截成5cm的小段且混合均勻，精確稱重后直立裝入適當的小燒杯中，補加10倍重量的水及菌液，淹沒其頂部，燒杯上蓋平皿以減少水分蒸發，在32℃恒溫箱中靜止處理。

1.7 HW201在亞麻漚麻過程中的作用

基本漚麻系統經過2次滅菌處理以保證系統的無菌狀態，接種HW201后進行漚麻處理，以不接種為對照，通過檢測漚麻過程微生物生長和原莖減重率情況，確定HW201發揮的作用。減重率指漚麻過程中重量減少的百分比。

1.8 雜菌確定

在漚麻系統中，通過平板分離觀察菌落形態與顯微觀察菌體形態，除HW201以外，其余皆計為雜菌。

2 結果與討論

2.1 培養特性

目的菌株在果膠—蛋白胨瓊脂平板上生長時，隨果膠濃度的提高，菌株產色素量也隨之提高，菌落周圍顏色加深，菌落直徑也隨之加大，說明目的菌株能有效利用果膠類物質作為碳源，具有分解果膠的能力。在以玉米粉—豆粕粉組成的培養基中搖床培養時，在48h后開始產生色素，培養基顏色由淡青色逐漸加深，在72h后變成棕黑色。目的菌株在普通的營養瓊脂培養基上生長良好，菌落污白色，邊緣不整齊，表面有皺褶，表面干燥，菌落中部凹陷，四周凸起，在斜面上培養時生長良好，呈峽谷狀。在營養瓊脂上生長48h的菌體，革蘭氏染色陽性，在顯微鏡下觀察時，呈長桿狀，多數單生，極少量兩桿直線相連;芽孢近中生，卵圓形，不膨大(圖1);在水片的顯微鏡觀察時，菌體有運動性，表明鞭毛的存在。

2.2 菌株鑒定

依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版［15］中的芽孢桿菌分類標準和周德慶主編《微生物學實驗手冊》［13］中的方法，對目的菌株進行了生理特性試驗(表1)。根據試驗的結果，確定目的菌株是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。為進一步確定目的菌株的種屬地位，利用BioFosun微生物鑒定系統，選擇BioFosun GB3測試版，對目的菌株進行了鑒定。在測試版上呈現的圖譜，經過BioFosun菌種鑒定系統判定，確定目的菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，定名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HW201。

圖1 目的菌株在營養瓊脂上生長48h后的菌體形態(1200×)Fig.1 The growth form on nutrient agar after 48h of Bacillus subtilis HW201

表1 目的菌株的部分生理特性Tab.1 The physiological characteristics of Bacillus subtilis HW201

2.3 產酶特性

產酶培養基以切成小段的亞麻莖稈和0.1%硫酸銨組成。在培養基中接種目的菌株，保溫30℃ ～32℃，搖床培養72h后測定各種酶的活性(表2)。在此條件下，目的菌株不產生纖維素酶，產生微弱的蛋白酶和淀粉酶，在檢測的各種果膠酶中，聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的含量最豐富，另外也產生了少量的果膠酯酶(PE)，而聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)和聚半乳糖醛酸酶(exo-PG)未檢測出。

表2 目的菌株的產酶特性Tab.2 The enzyme peoperties of the Bacillus subtilis HW201

基于聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)在脫膠過程中起主要作用，筆者研究了聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的主要性質。試驗結果表明，該酶在中性及35℃的條件下表現出最大的活性，與溫度相比較，pH對酶活力的影響更大(圖2)。酶液在pH 7.0的緩沖溶液中，在不同的溫度下保溫10min后，立即取樣測定剩余的酶活力，以0h酶活力為100%計算相對酶活力，結果表明，該酶在50℃以下時酶活力穩定，高于此溫度后酶活力逐漸下降;該酶在沸水中處理10min后酶活力殘余15%以下，處理30min后完全失活(圖3)。分別在反應底物溶液中加入1.0mmol/L的各種金屬離子，然后測定酶活力，以未加入任何離子的酶活力為100%。結果表明，在此濃度下Ca2+、Mg2+對酶有明顯的激活作用，Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+有不同程度的抑制作用，其中 Mn2+的抑制率達95%(圖4)。

圖2 溫度及pH對PGL酶活性的影響Fig.2 The effected on enzime activity of PGL pH and temperature

圖3 PGL的溫度穩定性Fig.3 The temperature stability of PGL

圖4 金屬離子對PGL酶活力的影響(1.0mM/L)Fig.4 The effect on enzyme actuvity of PGL by matel ions

2.4 HW201對亞麻漚麻過程的影響

用10倍重量0.4%尿素溶液浸沒切成小段的亞麻原莖，接種0.2%菌液，置32℃保濕溫箱中靜止培養，觀察漚麻過程中各種成分的變化情況。結果表明漚麻液中HW201的生長持續到36h，以后趨于穩定;隨漚麻進程的進行，雜菌生長也同樣迅速，在36～48h時達到穩定，并在數量上超過HW201(圖5);HW201可以在漚麻液中生長并發揮其加速漚麻的作用。漚麻液中總糖、可溶性氮、可溶性磷的消耗與微生物的生長相對應，在36h前迅速下降，以后消耗速度緩慢，與后期微生物的生長呈現的停滯相一致，而可溶性氮的含量在后期的回升是菌體死亡后自溶釋放出含氮物質的結果(圖6和圖7)。對漚麻進程中的pH，前期下降，以后又緩慢回升，但總體上穩定在5.8～6.9。以0.4%尿素溶液直接浸泡亞麻原莖作對照，進行亞麻原莖減重試驗的結果表明，HW201的作用在12h后開始顯現，并在隨后的進程中明顯提高漚麻液對亞麻原莖的減重效果(圖8)。說明HW201對原莖中不溶性物質的溶出是十分有利的。

2.5 枯草芽孢桿菌HW201漚麻條件

圖5 漚麻過程中HW201與雜菌的變化Fig.5 The change of Bacillus subtilis HW201 and the other bacteria in Retting process for flax

圖6 接種HW201對漚麻過程中溶性總糖的影響Fig.6 The effects on the total soluble sugar in the retting process by Inoculated Bacillus subtilis HW201

圖7 接種HW201對漚麻過程中溶性氮磷的影響Fig.7 The effects on the total soluble nitrogen and phosphorus in the retting process by Inoculated Bacillus subtilis HW201

為了解傳統溫水漚麻工藝中的各種工藝參數對HW201漚麻作用效果的影響，進行了單因子試驗研究。在漚麻水中添加了0.4%尿素，溫度、pH、固液比和接種量以試驗要求確定，漚麻時間48h，以亞麻原莖減重率作為漚麻效果和進程的指標。結果表明，適宜的漚麻溫度與HW201的適宜生長溫度是一致的，在32℃ ～38℃的范圍內都取得了較好的減重效果，34℃時減重率最大(圖9);初始pH值也表現出類似的結果，在中性附近條件下，減重率較大，與HW201的生長要求也是一致的。但試驗過程中觀察到偏酸性的環境中，前期漚麻液色度比較重，暗示了酸性條件可以加快可溶性物質的溶出速度;隨接種量的提高，原莖減重率呈現出上升趨勢，總體上對原莖減重率影響不大;隨固液比的降低，原莖減重率上升趨勢，顯微觀察漚麻液中的微生物豐度也隨之上升，表明低的固液比條件下，漚麻液中營養相對豐富，有利于微生物的生長。

圖8 接種HW201對漚麻過程中亞麻原莖減重影響Fig.8 The effects on the reductive Weight in the retting process by Inoculated Bacillus subtilis HW201

圖9 漚麻條件對HW201作用效果的影響Fig.9 The effect on retting results by the conditions

表3 HW201漚麻試驗結果Tab.3 The results of joint retting with Bacillus subtilis HW201 and penetration enhancers

2.6 枯草芽孢桿菌HW201漚麻效果

漚麻試驗在1 000mL燒杯中進行，亞麻原莖切成12cm長小段，緊密地豎直裝入杯中，重量為85g左右，加漚麻水浸沒亞麻原莖，高出約0.5cm，實際加水量約760mL;漚麻水含0.4%尿素、0.2%枯草芽孢桿菌HW201菌液;靜止保溫32℃，漚麻至終點;終點以經驗判斷。以清水直接漚麻作為對照試驗。漚麻結束后的麻莖，扒取亞麻纖維進行成分測定(表3)，總體上兩者比較一致，使用新的漚麻方法達到了傳統工藝的水平。

3 結語

在亞麻溫水漚麻過程中，其漚麻液的基本環境適合一些細菌的生長，在前期進行的分離篩選過程中，觀察到原始漚麻液中的微生物區系主體是芽孢桿菌、假單胞菌及其他一些種屬的細菌。本研究中的目的菌株分離自漚麻液，在漚麻試驗中表現優異，經鑒定是一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在加菌溫水漚麻其他一些研究結果中，使用的微生物集中在芽孢桿菌屬，如費氏芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等，研究結果與之是一致的。針對目的菌株進行的產酶試驗，沒有檢測出纖維素酶，同時進行的長達一周的濾紙崩解試驗，濾紙沒有明顯變化，試驗結果表明目的菌株對亞麻纖維不會產生降解作用。目的菌株產生少量的果膠脂酶(PE)與比較豐富聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)，它們是脫膠過程中的主力酶，其最適的作用條件與漚麻條件基本一致，能夠保證其酶解作用的高效進行。漚麻液中的各種金屬離子對聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)有不同的影響，控制Ca2+、Mg2+在適當的濃度對促進脫膠有重要作用，而為保證漚麻過程的順利進行，漚麻液中 Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+尤其是 Mn2+的含量需要得到控制。

對于亞麻原莖提取液的成分分析和進行的枯草芽孢桿菌HW201培養試驗的結果皆表明，漚麻液中的氮源缺乏，需要補充。在補充0.4%尿素的條件下，枯草芽孢桿菌HW201能夠在漚麻液中進行生長和繁殖。在嚴格無菌條件下，利用HW201進行純菌漚麻和原漚麻液直接浸泡的結果差異說明了HW201在漚麻過程中起到的作用，同時也再次證明了漚麻過程中微生物的重要性。在漚麻液中，HW201和其他雜菌的生長是同步進行的，與漚麻液中營養物質的消耗是相對應的，由于人為接種HW201的因素，使HW201的起始豐度較大，在漚麻前期HW201的數量一直占有優勢，在后期可能是因為營養物質的匱乏使得HW201生長停滯，而雜菌得到更大的發展空間。在試驗的漚麻條件中，固液比對漚麻有比較大的影響，降低固液比后漚麻液中的微生物生長更加旺盛，明顯縮短了漚麻周期，漚麻處理后的麻纖維在化學成分上與傳統生產工藝基本一致。

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