肝細胞生長因子誘導敏感非小細胞肺癌細胞對吉非替尼耐藥及機制的研究

玄香蘭 安昌善 周彩存

吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI），是目前最常用的治療非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）分子靶向藥物。由于吉非替尼對患者的選擇性，僅部分NSCLC患者對吉非替尼有效，存在原發或獲得耐藥，這種耐藥機制不十分清楚。c-Met是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）的受體，新近研究[1]顯示，肺癌組織中MET基因的擴增與對吉非替尼獲得性耐藥有關。本研究選擇NSCLC細胞EGFR突變型PC-9和EGFR野生型H292，用HGF誘導這兩株細胞，應用MTT法檢測細胞增殖、周期及凋亡，利用蛋白質免疫印跡技術檢測細胞中c-Met、p-Met的表達，旨在研究HGF誘導不同基因型NSCLC對吉非替尼耐藥及耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株PC-9、H292由上海肺科醫院中心實驗室凍存提供；HGF購自以色列PROSPEC公司，吉非替尼購自武義金色年華藥物研發公司，Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit為BioVision公司產品，Flow Cytometry Analysis of Cell Kit為上海杰美基因醫藥有限公司產品，鼠抗人p-EGFR（Tyr1068）、兔抗人p-Met（Tyr1234/1235）及c-Met購自Cell Signaling Technology公司，小鼠抗人β-actin單抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG抗體為武漢博士德產品。

1.2 細胞培養及藥物配制 將存有PC-9和H292的液氮凍存管迅速放入37oC恒溫水浴箱快速融化，PBS洗滌后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，5%CO2、37oC恒溫細胞培養箱中孵育，每3-4天換液傳代。HGF 10 μg加入100 μL無菌雙離子水稀釋成100 μg/mL的母液。吉非替尼原料用DMSO溶解稀釋成濃度為50 μmol/mL的母液，用藥時DMSO終濃度要小于0.1%。

1.3 測定細胞活性及藥物半數抑制濃度（IC50） 取100 μL含細胞數為5×103個的細胞懸液接種于96孔板。待細胞貼壁后加入100 μL含有HGF或（和）不同濃度吉非替尼的培養液。72 h后每孔內加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h，離心，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，搖床上充分混勻1 h，待結晶完全溶解。最后用酶標儀測量波長530 nm時OD值；細胞存活率=（每組平均OD值-試劑空白/對照組平均OD值-試劑空白）×100%；實驗重復3次，用細胞存活率做出量效曲線，用作圖法分析得出兩種藥物對不同細胞的IC50。

1.4 細胞周期的檢測 取1×105個對數生長期細胞接種于6孔板，貼壁后棄原培養液，用PBS清洗2遍，加入含有HGF或（和）吉非替尼培養液，培養48 h，胰酶消化并收集全部細胞，離心去上清液，冷PBS洗滌2次，加1 mL固定液，固定2 h以上。離心去上清液，冷PBS洗滌2次, 加入500 μL標記液（500 μL Assay Buffer+10 μL RNase A+10 μL PI），避光、室溫孵育30 min，過濾后流式細胞儀檢測細胞周期，用Multicycler 3.0軟件分析結果。實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡的檢測 取1×105個對數生長期細胞接種于6孔板，貼壁后棄原培養液，用PBS清洗2遍，加入含有HGF或（和）吉非替尼培養液，培養48 h和72 h，胰酶消化并收集全部細胞，離心去上清液，冷PBS洗滌2次。加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-PE混勻，避光、室溫反應5 min，過濾后流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測細胞蛋白 取對數生長的細胞，給予相應處理后立即冰上裂解細胞，4oC、12,000 rpm、30 min、離心收集各組蛋白裂解液。用BCA蛋白定量法蛋白定量。取30 μg-40 μg蛋白經8%-10%SDS-PAGE電泳分離后，轉印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4oC過夜，TBST洗膜10 min、3次后二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜5 min、5次后ECL化學發光試劑顯色、曝光成像。

1.7 統計學分析 數值以均數±標準差來表示，采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。以配對t檢驗進行統計學比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吉非替尼或/和HGF處理的藥物濃度-生長曲線 吉非替尼對PC-9和H292的IC50分別為（0.05±0.01）μmol/L和（0.17±0.05）μmol/L。隨著吉非替尼濃度的升高，72 h內細胞存活率減少，即吉非替尼對PC-9和H292的生長抑制作用呈濃度依賴性，藥物濃度越高細胞存活率越低（圖1）。當PC-9和H292用HGF（40 ng/mL）和不同濃度吉非替尼同時處理時，其藥物濃度-生長曲線往右移（圖1）。當用HGF（40 ng/mL）和不同濃度吉非替尼同時處理時，吉非替尼對PC-9和H292的IC50值均大于1 μmol/L，而且估計H292的IC50遠大于1 μmol/L。

2.2 不同濃度HGF誘導PC-9和H292對吉非替尼耐藥 實驗共分4組：對照組（C）、HGF誘導組（H）、吉非替尼處理組（G）、HGF誘導和吉非替尼處理組（HG）。PC-9和H292先用HGF（40 ng/mL）誘導24 h后再用吉非替尼處理72 h，結果與G組存活率無統計學差異（P＞0.05），而同時用HGF和吉非替尼處理組與單純用吉非替尼處理組細胞存活率更高，兩組間有統計學差異（P＜0.05）（圖2）。所以上述藥物濃度-存活率以及接下來的實驗均采用HGF和吉非替尼同時加入的方法來處理。HGF（40 ng/mL）并沒有影響肺癌細胞PC-9和H292的增殖，但HGF能誘導肺癌細胞對吉非替尼耐藥，G組和HG組的存活率有統計學差異（P＜0.05）（圖3）。用低濃度HGF（20 ng/mL）處理沒有影響PC-9和H292的增殖，但低濃度HGF也能誘導肺癌細胞對吉非替尼耐藥，G組和HG組的存活率有統計學差異（P＜0.05）（圖3）。

圖1 吉非替尼或/和HGF處理的濃度-存活率曲線（HGF誘導時曲線往右移）Fig1 The concentration-survival curve when treating with gefitinib or/and HGF (curve shifts right when induced by HGF)

圖2 HGF（40 ng/mL）誘導不同時間（0 h、24 h）后吉非替尼（1 μmol/L）處理對肺癌細胞PC-9和H292存活率的影響。C：對照組；H：HGF誘導組；G：吉非替尼處理組；HG：HGF誘導和吉非替尼處理組。▽:與吉非替尼處理組（G）相比，P＜0.05。Fig2 The effects of cells survival when treating with gefitinib after induced by HG (40 ng/mL) in different time (0 h, 24 h). C: control group; H: HGF group; G: gefitinib group; HG: HGF+gefitinb group. ▽: compared with the G group, P＜0.05.

2.3 HGF誘導吉非替尼耐藥對細胞凋亡的影響 光鏡下觀察，吉非替尼能明顯促進PC-9凋亡，而吉非替尼對促進H292的凋亡作用并不明顯。因此我們只選擇凋亡作用明顯的PC-9來說明凋亡在HGF誘導吉非替尼耐藥過程中的影響。根據MTT檢測的陽性結果選擇不同濃度HGF（20 ng/mL、40 ng/mL）及吉非替尼（0.1 μmol/L）不同時間（48 h、72 h）處理PC-9。結果HG組凋亡率與G組相比有減少趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）（圖4）。

2.4 HGF誘導吉非替尼耐藥對細胞周期的影響 PC-9和H292經HGF（20 ng/mL）或/和吉非替尼（0.1 μmol/L）各處理48 h。吉非替尼明顯增加PC-9的G1期細胞比例，但G組與HG組比較無統計學差異（P＞0.05）。吉非替尼略增加H292的G1期細胞比例，但與HG組比較無統計學差異（P＞0.05）（圖5）。

2.5 HGF激活c-Met磷酸化 為了明確HGF誘導肺癌細胞對吉非替尼耐藥機制，應用Western blot檢測c-Met和p-Met表達。HGF作用能明顯刺激PC-9和H292中c-Met的自身磷酸化（圖6）。PC-9為EGFR突變株，對吉非替尼十分敏感，吉非替尼對PC-9的IC50值為0.05 μmol/L。PC-9的HG組c-Met的磷酸化表達不明顯，但與G組相比c-Met的磷酸化表達稍有增加（圖6）。H292為EGFR野生株，但對吉非替尼敏感，吉非替尼對H292的IC50值為0.17 μmol/L。HG組以及H組c-Met的磷酸化均明顯增加，H292的HG組與G組相比c-Met的磷酸化明顯增加（圖6）。

圖3 HGF（20 ng/mL、40 ng/mL）或/和吉非替尼對肺癌細胞存活率的影響。▽：與吉非替尼處理組（G）相比，P＜0.05。Fig3 The effects of cells survival when treated with gefitinib or/and HGF (20 ng/mL, 40 ng/mL). ▽: compared with the G group, P＜0.05.

圖4 HGF誘導耐藥對細胞凋亡的影響Fig4 The effects of apoptosis in gefitinib resistence induced by HGF

圖5 HGF誘導耐藥對細胞周期的影響。G0/G1：DNA復制前期；S：DNA復制期；G2/M：DNA分裂期。Fig5 The effects of cell cycle in gefitinib residence induced by HGF. G0/G1: prophase of DNA; S: replicative phase of DNA;G2/M: mitotic phase of DNA.

圖6 HGF誘導PC-9和H292細胞c-Met及p-Met表達Fig6 Expression of c-Met and p-Met in PC-9 and H292 induced by HGF

3 討論

EGFR-TKIs對NSCLC患者有效率約為10%-20%[2]，也就是說80%-90%的NSCLC患者對EGFR-TKIs耐藥。EGFR突變與EGFR-TKIs有效率有很大的相關性，但突變患者中70%-75%有效[3]，而25%～30%突變者則無效。NSCLC的野生型患者有10%～15%的有效率，野生型者中有85%-90%是耐藥患者[4]。NSCLC患者存在原發性或獲得性對EGFRTKIs耐藥，其耐藥機理尚未完全明確，EGFR的二次突變與MET基因的擴增被認為是吉非替尼獲得性耐藥的重要機制。HGF屬于成纖維細胞的衍生因子，惡性腫瘤患者血清中HGF含量明顯升高，與腫瘤的侵襲狀態密切相關[5]。HGF與特異性c-Met受體結合而發揮作用，促進多種組織細胞增生分裂、促細胞運動和促血管生成[6]。

我們選擇對吉非替尼敏感的EGFR突變肺腺癌細胞型PC-9和EGFR野生型H292，這兩株細胞不存在EGFRT790M突變或MET擴增或KRAS突變等吉非替尼耐藥相關因素。本研究細胞活性檢測顯示HGF單獨沒有促進細胞增殖，但HGF誘導與非HGF誘導的藥物濃度-存活率曲線相比，HGF誘導的藥物濃度-存活率曲線明顯往右移，提示HGF誘導細胞存活。PC-9和H292的HG組比G組均有更高的存活率（P＜0.05）。從IC50的變化、藥物濃度-存活率曲線、細胞存活率的結果看出，HGF不僅誘導敏感肺癌細胞對吉非替尼耐藥，而且與EGFR突變型和野生型無關。在HGF和吉非替尼用濃度相同處理下，耐藥影響在EGFR野生型中的表現更明顯，提示野生型細胞更容易受HGF的干擾。

本研究中HGF誘導的PC-9凋亡率并沒有比對照組減少，可忽略細胞凋亡作用在HGF誘導耐藥中的影響。HGF能明顯減少H292的G1期細胞比例，增加S期和G2期細胞比例。經過吉非替尼處理的誘導組G1期細胞比例與非誘導組相比沒有差異，提示細胞周期的影響可能與HGF誘導耐藥無關。

腫瘤細胞除了表達EGFR外同時還表達其它含酪氨酸激酶活性的跨膜受體，稱之為EGFR旁路TK信號，包括c-Met，它們所引導的信號通路常常重疊、功能上發生碰撞[7]。c-Met廣泛存在于多種正常組織細胞和體內外惡性腫瘤細胞內。正常情況下HGF/c-Met信號途徑參與胚胎發生，而異常的HGF/c-Met信號途徑與腫瘤的發生和發展密切相關，特別是在促進腫瘤細胞的侵襲和轉移方面起重要作用[8]。在NSCLC患者中c-Met陽性表達者比c-Met陰性表達者存活率低，HGF和c-Met共表達者比任何一種陽性表達者或者兩種均陰性表達者相比存活率明顯降低[9]。

本實驗顯示，HGF誘導組包括HG組和H組均增加表達c-Met的磷酸化。兩種細胞的HG組均比G組增加表達c-Met的磷酸化，這可能是HGF誘導敏感細胞對吉非替尼耐藥的機制。本研究中PC-9是EGFR突變株，HGF誘導的c-Met磷酸化被吉非替尼抑制；而H292是EGFR野生株，HGF誘導的c-Met磷酸化不被吉非替尼抑制。雖然在EGFR突變株，HGF誘導的c-Met的磷酸化被吉非替尼所抑制，但從EGFR野生株的表現中可以看出，HGF通過激活c-Met的磷酸化誘導敏感肺癌細胞對吉非替尼耐藥。EGFR和c-Met都擁有廣泛的信號網絡，兩種受體介導的信號通路廣泛交錯，分別依賴于EGFR和c-Met的細胞的信號網絡。吉非替尼抑制HGF活化的c-Met的磷酸化在不同基因類型細胞之間的表現不一致，這為臨床指導治療不同基因型耐藥NSCLC提供理論依據。

HGF雖然是本研究中介入的外源性生長因子，但先前就有文獻[10]報道肺癌組織能夠高表達HGF。HGF以自分泌或旁分泌的方式作用于其受體c-Met[11]，HGF誘導NSCLC對吉非替尼耐藥可能屬于原發性耐藥。本實驗提示少數EGFR突變患者及多數EGFR野生型患者對吉非替尼耐藥的可能原因是HGF誘導NSCLC細胞表達的c-Met發生磷酸化。HGF/c-Met系統介導NSCLC對吉非替尼的耐藥，如果聯合HGF/c-Met信號靶向治療可能有利于提高肺癌患者對吉非替尼的敏感性。