ARMS技術(shù)聯(lián)合Taqman探針檢測100例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變

趙靜 趙金銀 趙肖 陳唯軍 鐘巍 張力 李龍蕓 王孟昭

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，該區(qū)域的激活對非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的增殖、生長相關(guān)信號傳遞具有重要意義。大量研究[1-3]表明，EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）療效最重要的預(yù)測因子，故在晚期NSCLC中檢測EGFR基因突變狀態(tài)至關(guān)重要，是決定患者能否一線應(yīng)用EGFR-TKI的先決條件。EGFR基因突變檢測方法有很多，其中Scorpions ARMS法具有檢測靈敏度高、操作簡便、結(jié)果容易判讀、省時等諸多優(yōu)點，在一些大型臨床研究[2]中被廣泛采用，但其高昂的檢測費用并不適合我國國情。為此，我們自主設(shè)計了EGFR基因常見突變的ARMS引物，并聯(lián)合Taqman探針技術(shù)建立了一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及靈敏的檢測方法，并取得了滿意效果，特此匯報。

1 材料與方法

1.1 ARMS引物及Taqman探針的設(shè)計 在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI）數(shù)據(jù)庫下載EGFR全基因序列。EGFR Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突變信息分別為2235_2249 del 15和2573 T＞G。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件在E746_A750和L858R處設(shè)計ARMS引物，其長度約22個堿基，GC含量為40%-60%，Tm值為58oC-60oC，擴(kuò)增片段大小為80 bp-150 bp。Taqman探針長度為26個-30個堿基，GC含量為40%-60%，Tm值為68oC-70oC。另在EGFR Exon 2上設(shè)計引物和探針，作為內(nèi)參。以攜帶Exon 19 E746_A750缺失突變和Exon 21 L858R點突變的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（由中國科學(xué)院北京基因組研究所贈送）為研究對象，篩選和確立最佳引物和探針。

熒光定量PCR反應(yīng)體系如下（20 μL反應(yīng)體系）：2×Taqman Universal PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，探針（10 μM）0.4 μL，DNA模板 （2 ng/μL-20 ng/μL）2 μL，純水定容至20 μL。PCR反應(yīng)程序：50oC、5 min ；95oC預(yù)變性10 min；40個循環(huán)：95oC、15 s、60oC、45 s（收集熒光）。

1.2 靈敏性試驗 將Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按100copies/μL、1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL、1×105copies/μL進(jìn)行梯度稀釋，按1.1所建立的方法，進(jìn)行靈敏性試驗，每個梯度設(shè)3個重復(fù)孔。

1.3 敏感性試驗

1.3.1 19外顯子缺失突變敏感性試驗 將Exon 19 E746_A750 del突變型質(zhì)粒分別加入到500 copies/μL和5,000 copies/μL的Exon 19野生型質(zhì)粒（由中國科學(xué)院北京基因組研究所贈送）中，制成突變率（突變型基因與野生型基因拷貝數(shù)百分比）依次為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的樣本，按1.1所建立的方法進(jìn)行檢測，以確定其檢測敏感性。

1.3.2 21外顯子點突變敏感性試驗 將Exon 21 L858R突變型質(zhì)粒分別加入到500 copies/μL和5,000 copies/μL的Exon 21野生型質(zhì)粒（由中國科學(xué)院北京基因組研究所贈送）中，制成突變率依次為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的樣本，按1.1所建立的方法進(jìn)行檢測，以確定其檢測敏感性。

1.4 特異性試驗及cutoff值確定 以10份正常人白細(xì)胞DNA為研究對象，濃度范圍1 ng/μL-50 ng/μL，進(jìn)行6次重復(fù)性試驗，統(tǒng)計每次出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增Ct值及樣本的內(nèi)參Ct值，計算出ΔCt值（ΔCt=Ct非特異-Ct內(nèi)參）。依據(jù)公式cutoff ΔCt=平均ΔCt-3×Sd-3，計算出cutoff ΔCt。

1.5 100份NSCLC組織標(biāo)本的檢測

1.5.1 標(biāo)本收集、DNA提取 NSCLC標(biāo)本來自2008年12月-2010年12月北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科肺癌病房收治，且經(jīng)臨床、影像以及病理診斷為非小細(xì)胞肺癌患者，共100例，其中男性53例，女性47例；腺癌71例（包括細(xì)支氣管肺泡癌5例），鱗癌22例，其它7例（包括腺鱗癌1例，未定型6例）；既往采用Scorpions ARMS法檢測過的標(biāo)本29例。每例患者提供石蠟切片5張。采用離心柱法提取石蠟切片DNA（使用商品化Tiangen組織樣本基因組DNA提取試劑盒）。最后，使用紫外分光光度計測定DNA濃度，調(diào)整DNA濃度于2 ng/μL-20 ng/μL之間，凍存于-20oC冰箱備用。

1.5.2 ARMS聯(lián)合Taqman探針技術(shù)檢測NSCLC組織EGFR基因突變

1.5.2.1 陽性對照品制備 以提取的20 ng/μL正常人全基因組DNA為背景，加入Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突變型質(zhì)粒，制成1:1的突變陽性對照品。

1.5.2.2 臨床樣本的檢測 按照1.1所建立的ARMS-Taqman PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序?qū)λ占呐R床樣本進(jìn)行檢測，每一份樣本均設(shè)立一個陰性對照樣本（以純水代替）和一個陽性對照樣本。

計算出每個樣本的ΔCt（ΔCt=Ct突變反應(yīng)-Ct內(nèi)參），依據(jù)1.4所建立的cutoff ΔCt值判斷結(jié)果。若ΔCt值小于cutoff ΔCt值，則為陽性樣本；若ΔCt值大于cutoff ΔCt值，則為陰性樣本或超出檢測范圍。

對ARMS-Taqman PCR檢測陽性的標(biāo)本均進(jìn)行測序驗證，測序由上海生工完成。

2 結(jié)果

2.1 ARMS引物及Taqman探針 以2外顯子為內(nèi)參。表1列出了2外顯子內(nèi)參引物，19外顯子缺失突變ARMS引物、21外顯子點突變ARMS引物，以及用于各自擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的Taqman探針序列。

2.2 ARMS-Taqman PCR反應(yīng)體系檢測靈敏度結(jié)果 對EGFR基因突變檢測的2個反應(yīng)（19 Del和21 L858R），ARMSTaqman PCR方法最低可檢測至1×101copies/μL。圖1、圖2分別顯示19 Del和21 L858R檢測反應(yīng)。

2.3 ARMS-Taqman PCR反應(yīng)體系檢測敏感性結(jié)果 對于19 Del突變，如圖3，在500 copies/μL的野生型質(zhì)粒背景下，可檢出突變率為1%；如圖4，在5,000 copies/μL的野生型質(zhì)粒背景下，可檢出突變率為0.5%。對于21 L858R，如圖5，在500 copies/μL的野生型質(zhì)粒背景下，可檢出突變率為1%；如圖6，在5,000 copies/μL的野生型質(zhì)粒背景下，可檢出突變率為0.1%。

表 1 檢測EGFR基因Exon 19 E746_A750 del和Exon 21 L858R突變所設(shè)計的ARMS引物和Taqman探針序列Tab 1 Sequences of ARMS primers and Taqman probes designed for the detection of Exon 19 E746_A750 del and Exon 21 L858R mutations in EGFR gene

圖1 19 Del檢測曲線，19 Del突變型質(zhì)粒濃度梯度依次為：1×105 copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102 copies/μL、1×101 copies/μL。Fig1 The amplification curves of 19 Del mutation (the concentrations of mutant plasmid was 1×105 copies/μL, 1×104 copies/μL, 1×103 copies/μL, 1×102 copies/μL and 1×101 copies/μL, respectively).

圖2 21 L858R檢測曲線，21 L858R突變型質(zhì)粒濃度梯度依次為：1×105 copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102 copies/μL、1×101 copies/μL。Fig2 The amplification curves of 21 L858R mutation (the concentrations of mutant plasmid was 1×105 copies/μL,1×104 copies/μL, 1×103 copies/μL, 1×102 copies/μL and 1×101 copies/μL,respectively).

圖3 19 Del在500 copies/μL野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突變率，ARMS-Taqman PCR可檢出含1%突變率樣本。Fig3 The 19 Del mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 500 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 1%.

圖4 19 Del，在5,000 copies/μL野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突變率，ARMS-Taqman PCR可檢出含0.5%突變率樣本。Fig4 The 19 Del mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 5,000 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 0.5%.

圖5 21 L858R，在500 copies/μL野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突變率，ARMS-Taqman PCR可檢出含1%突變率樣本。Fig5 T he 21 L 858 R mut ation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids(under the background of 500 copies/μL wild-type plasmids) showed the detection resolution was 1%.

圖6 21 L858R，在5,000 copies/μL野生型質(zhì)粒背景下，依次存在10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0%的突變率，ARMS-Taqman PCR可檢出含0.1%突變率樣本。Fig6 The 21 L858R mutation amplification curves for different concentrations of mutant plasmids (under the background of 5c000 copies/μL wild-type plasmids)showed the detection resolution was 0.1%.

圖7 樣本1 Exon 19 E746_A750 Deletion突變：熒光檢測與測序結(jié)果Fig7 Exon 19 E746_A750 Deletion mutation (sample 1): the results of ARMS-Taqman and sequencing

圖8 樣本2 Exon 21 L858R突變：熒光檢測與測序結(jié)果Fig8 Exon 21 L858R mutation (sample 2): the results of ARMS-Taqman and sequencing

表 2 Cutoff ΔCt值統(tǒng)計結(jié)果Fig2 The summary of cutoff ΔCt values

2.4 ARMS-Taqman PCR反應(yīng)體系cutoff ΔCt值 對于檢測特異性，如表2所示，19 Del未見非特異性擴(kuò)增，cutoff ΔCt設(shè)定為10。而21 L858R突變存在一定程度的非特異性擴(kuò)增（6/60），根據(jù)計算公式，cutoff ΔCt為10。

2.5 100例NSCLC臨床樣本檢測結(jié)果 100例NSCLC組織標(biāo)本，采用ARMS-Taqman PCR檢測EGFR基因突變，結(jié)果顯示，19 Del 21例，21 L858R 18例，總突變率為39.0%（39/100）。從EGFR基因突變分布看，19 Del占51.2%（21/39），21 L858R占43.9%（18/39）。

對ARMS-Taqman檢測陽性標(biāo)本進(jìn)行測序驗證，結(jié)果顯示，測序結(jié)果與ARMS-Taqman熒光檢測結(jié)果完全一致。圖7、圖8分別顯示19 Del和21 L858R ARMS-Taqman檢測結(jié)果與測序結(jié)果。

100例NSCLC標(biāo)本中，有29例標(biāo)本既往曾采用Scorpions ARMS法進(jìn)行過EGFR基因突變檢測。在這29例標(biāo)本中，Scorpions ARMS法檢出19 Del 3例，占10.3%（3/29），21 L858R 6例，占20.7%（6/29），總突變率為31.0%（9/29）。對這29例標(biāo)本， ARMS-Taqman法檢出19 Del 3例，占10.3%（3/29），21 L858R 5例，占17.2%（5/29），總突變率為27.6%（8/29）。兩種方法19 Del突變檢出一致率為93.1%，Kappa=0.627；21 L858R突變檢出一致率為96.6%，Kappa=0.890。

3 討論

多項臨床研究[1-6]表明：與標(biāo)準(zhǔn)化療相比，具有EGFR基因突變的NSCLC患者使用EGFR-TKI，具有更高的客觀緩解率和PFS，同時患者生活質(zhì)量更佳。鑒于此，早在2011版NCCN NSCLC指南就明確指出，對于IV期非鱗NSCLC患者，應(yīng)先行EGFR基因突變檢測，如果存在EGFR基因突變，治療上優(yōu)先推薦EGFR-TKI。可見，EGFR基因突變的檢測對指導(dǎo)患者個體化治療方案的制定具有重要意義。

目前，已經(jīng)報道的EGFR基因突變類型大約有60種[7]，其中29種突變最為常見，包括19種19 Del、3種20 Ins、 21 L858R、21 L861Q、20 T790M、20 S768I、18 G719A、18 G719S和18 G719C，它們約占EGFR基因突變類型的99%[8]，其它EGFR基因突變類型罕見，而且和EGFR-TKI療效之間的關(guān)系并不確切，因此并未在臨床上指導(dǎo)EGFR-TKI的使用，故僅對這29種常見EGFR基因突變進(jìn)行檢測，足以滿足臨床所需。

關(guān)于EGFR基因突變檢測的方法有很多，各國學(xué)者對此都進(jìn)行了大量研究。已經(jīng)報道的方法包括[9]：直接測序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、Taqman PCR、ME-PCR等。這些方法各有優(yōu)缺點，其中在臨床和科研中較為常用的方法為直接測序法和Scorpions ARMS法。直接測序法檢測能力有限，其檢測敏感性約20%左右，而且步驟復(fù)雜、費時費力，但該方法的優(yōu)點是能夠發(fā)現(xiàn)一些新的未知突變。Scorpions ARMS方法是英國QIAGEN公司開發(fā)的一種商業(yè)化試劑盒，其即是針對上述常見29種EGFR基因突變進(jìn)行檢測，該方法是將分子信標(biāo)（Scorpions探針、蝎形探針）與特異性的ARMS引物相結(jié)合創(chuàng)造出來的，ARMS引物3’端設(shè)計在突變位點，最后一個堿基與突變堿基配對，只有引物3’末端完全配對時，才能正常擴(kuò)增，當(dāng)引物3’末端發(fā)生錯配時，不能有效的擴(kuò)增。當(dāng)引物與突變模板結(jié)合并延伸出相應(yīng)的產(chǎn)物后，引物5’端的探針部分自身雙鏈解開并與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，而使分子信標(biāo)兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離產(chǎn)生熒光。該方法敏感性高達(dá)1%，同時還具有操作簡便、結(jié)果判讀容易、省時等多種優(yōu)點[10]。但是，因其能在一次PCR反應(yīng)中同時檢測這29種EGFR基因突變，眾多ARMS引物和Scorpions探針使得檢測費用昂貴，約4,000元/例，不適合我國NSCLC患者的常規(guī)檢測和篩查。

本研究中所建立的Taqman-ARMS檢測方法亦是針對這29種EGFR基因突變位點，通過自主設(shè)計的ARMS引物，同時使用普通的Taqman水解探針代替Scorpions探針，使得檢測成本大大降低，約300元/例。出于對知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，我們在此僅報道了針對19 Del和21 L858R位點設(shè)計的ARMS引物和Taqman探針。在無野生型基因以及背景DNA干擾的情況下，本研究所建立的ARMS-Taqman PCR方法檢測靈敏度可達(dá)10 copies，敏感性達(dá)0.1%-1%，同時具有較高的特異性。在對100例NSCLC臨床標(biāo)本的檢測中，本研究所創(chuàng)立的ARMSTaqman方法檢出EGFR基因突變率為39%（39/100），這與文獻(xiàn)[11-13]中報道的亞裔患者EGFR基因具有30%-50%左右的突變率的結(jié)果一致。從EGFR基因突變分布看，19 Del占53.85%（21/39），21 L858R占46.15%（18/39），這亦與文獻(xiàn)[8]中報道的EGFR基因突變分布情況較為吻合。在與Scorpions ARMS的比較研究中， 兩種方法具有較高的檢測一致率。

綜上，本研究所構(gòu)建的ARMS-Taqman法是一種快速、簡便以及具有較高靈敏度和特異性的EGFR基因突變檢測方法，價格低廉，值得在臨床上進(jìn)一步推廣和驗證。