慢病毒載體介導IL-24基因轉導人骨髓間充質干細胞的實驗研究

祁秋干 周清華 李印 李偉強 陳霏 秦建軍

腫瘤的復發與轉移是腫瘤治療失敗的主要原因，能準確發現腫瘤的微衛星灶，并將治療藥物靶向作用于腫瘤部位，是治療腫瘤直接而有效的途徑。近來研究[1]發現干細胞具有向腫瘤定向遷移的特性，利用干細胞為載體攜帶治療基因或藥物靶向治療腫瘤可能是腫瘤治療的新突破。人骨髓來源的間充質細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）具有在不同的誘導條件下向內胚層、中胚層和外胚層的所有類型細胞分化的潛能[2]， 而且取材方便、體外分離與增殖技術成熟等特點，在干細胞移植和基因治療中頗受青睞[3,4]。

白細胞介素-24（interleukin-24, IL-24）又稱黑色素瘤分化相關基因-7（melanoma differentiation associated gene 7, MDA-7）是又一個既能抑制腫瘤細胞生長和血管形成并誘導凋亡，同時又能刺激免疫細胞表達細胞因子的新型抑癌基因[5,6]。選擇性清除腫瘤細胞，而不損傷正常細胞，是最廣泛的“靶向”概念。腫瘤基因治療成功的關鍵在于有效基因載體的選擇，可以攜帶治療因子釋放到相應的靶器官而發揮生物學效應。

實驗基于以上研究背景，通過多位點Gateway技術[7]構建了攜帶IL-24基因的慢病毒表達載體pLVpuro/EF1-IL-24-IRES-EGFP，將其包裝成慢病毒，轉導入hBMSCs，使用嘌呤霉素進行篩選純化，以獲得過表達外源基因IL-24及報告基因EGFP的綠色熒光細胞，利用EGFP基因實現目的基因在體內外表達的示蹤定位，為下一步開展基因治療相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 帶啟動子的入門克隆pUp-EF1α、帶報告基因的入門克隆pTail-IRES-EGFP、目的載體pDEST-puromycin、入門載體pDONRTM221、ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix、BP ClonaseTMII和LR ClonaseTMII、LipofectamineTM2000、OneShot? Stbl3 Chemically Competent E. coli、239FT細胞株、CD分子單抗（CD29-APC、CD90-PE、CD34-FITC、CD45- FITC）均購自美國Invitrogen公司，hBMSCs由中山大學干細胞中心提供，CDS克隆（含IL-24基因）由中山大學干細胞中心項鵬教授饋贈，重組人IL-24 ELISA試劑盒購自美國RD公司，胎牛血清及L-DMEM均購自Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 入門克隆pDown-IL-24的構建和鑒定 引物設計：根據Genebank中IL-24基因（NM_006850）的cDNA序列，設計IL-24引物序列為： Forward: 5’-GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATCGATGGATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3’; Reverse: 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACGGGATCCTCAGAGCTTGT AGA ATTTC-3’。PCR擴增：在上述引物的作用下，以IL-24的cDNA為模板進行擴增，電泳檢測PCR產物，切膠回收純化目的條帶。BP重組反應：用側翼含attB位點的PCR產物與入門載體pDONRTM221進行重組反應。取2 μL反應產物轉化50 μL Stbl3感受態細胞。細胞涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，37oC過夜培養。鑒定：從平板挑單克隆接種于LB液體培養液中，37oC、220 r/min振搖過夜培養，菌液行PCR擴增驗證，挑取構建正確的菌落培養過夜，提取質粒DNA，測序驗證。

1.2.2 表達克隆pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP的構建和鑒定 將入門克隆pUp-EF1α、pDown-IL-24和pTail-IRES-EGFP與目的載體pDEST-puromycin在LR重組反應酶作用下重組，取2 μL重組反應液轉化50 μL Stbl3感受態細胞，氨卞西林LB培養平板篩選陽性重組克隆并擴增，菌液行PCR擴增驗證，挑取構建正確的菌落培養過夜，提取質粒DNA，測序驗證。

1.2.3 慢病毒的包裝和濃縮 將慢病毒包裝質粒ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix和載體質粒pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP以1:1的摩爾比例混合,在LipofectamineTM2000的作用下共轉染293FT細胞，置于37oC、5%CO2的培養箱中培養。12h 后換液，加入新鮮293FT細胞培養液。72h 后觀察有強綠色熒光及細胞融合現象時收集培養上清，4oC、4,500 r/min離心15 min，將病毒上清液用0.45 μm濾膜過濾以去除細胞碎片，4oC、50,000g高速離心90 min。用RNase-free L-DMEM懸浮病毒顆粒沉淀，標記LVIL-24，-80oC凍存備用。同法構建只含EGFP的空病毒，標記LV-EGFP。

1.2.4 慢病毒的滴度測定 接種293FT細胞于6孔板，每孔接種2×105個細胞，37oC培養過夜；第2天，將慢病毒溶液用無血清DMEM（不含抗生素）按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7進行系列稀釋，將其分別加入到相應的孔中，加入聚酰胺（Polybrene）終濃度至6 mg/L，置37oC、5%CO2培養箱培養。12 h后全量換液，加入新鮮的293FT培養液。第4天觀察熒光表達情況，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而減少，計數出表達熒光的細胞個數，將得到的數值乘以相應的稀釋倍數就得到病毒原液的滴度數。

1.2.5 hBMSCs培養及鑒定 常規復蘇凍存的hBMSCs，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養液，置于置37oC、5%CO2的培養箱培養，每2-3天常規換液。待細胞長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后約1周左右達90%融合。免疫組化及流式細胞術鑒定細胞表面標志物CD29、CD90、CD34和CD45。

1.2.6 慢病毒轉導hBMSCs及純化 用慢病毒LV-IL-24及LV-EGFP進行轉導傳代后狀態較好的hBMSCs，設單純hBMSCs為對照。分別加入病毒懸液20 μL和Polybrene（終濃度6 mg/L），置37oC、5%CO2的培養箱中培養。12 h后去除含病毒的培養液，換為L-DMEM培養液。連續感染3次后用L-DMEM培養液繼續培養。轉導后為了得到純化的感染細胞群，在轉導后第7天開始使用1 mg/L-5 mg/L嘌呤霉素進行篩選，篩選時間為7 d-10 d。純化后轉入IL-24基因的hBMSCs標記為hBMSCs-IL-24；轉入EGFP基因的hBMSCs標記為hBMSCs-EGFP。

1.2.7 轉導純化后的hBMSCs的鑒定分析 實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）檢測：收集hBMSCs-IL-24組、hBMSCs-EGFP組及對照組hBMSCs細胞，提取各組RNA，反轉錄cDNA，然后以cDNA為模板，行qPCR檢測各組中IL-24 mRNA的表達水平。 ELISA檢測：收集hBMSCs-IL-24組、hBMSCs-EGFP組及對照組hBMSCs細胞培養液上清，根據重組人IL-24 ELISA試劑盒操作說明檢測各組細胞的IL-24蛋白濃度水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件對IL-24評分結果進行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入門克隆pDown-IL-24的鑒定 經BP重組反應，挑選兩個入門克隆陽性菌落，質粒PCR擴增片段大小在600 bp-700 bp之間，與IL-24基因理論值一致（621 bp），見圖1。挑取構建正確的菌落培養過夜后提取質粒DNA，經測序鑒定目的基因序列與數據庫的IL-24基因序列吻合，表明成功構建入門克隆（pDown-IL-24）。

2.2 表達克隆pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP的構建和鑒定 經LR重組得到了表達克隆陽性菌落，提取克隆提取質粒行PCR擴增出目的片段包括表達基因IL-24（621 bp）、啟動子EF1α（1,264 bp）和報告基因EGFP（750 bp），結果與基因片段大小相符（圖2）。

2.3 慢病毒的包裝與濃縮 慢病毒載體共同轉染293FT細胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察，轉IL-24基因組及空病毒載體組均可見大量強綠色熒光，證實質粒轉染入293FT細胞，細胞部分融合，可見多核復合體出現（圖3）。收集病毒上清液高速離心后，用100 μL RNase-free L-DMEM分別溶解病毒顆粒。

2.4 慢病毒的滴度測定 將病毒原液（LV-IL-24）從1×10-2到1×10-7梯度稀釋后，感染293FT細胞2 d后，可見1×10-2到1×10-5孔均出現大量陽性細胞，而1×10-6到1×10-7孔陽性細胞數分別為45個和10個，根據公式病毒滴度=陽性細胞數×病毒上清稀釋倍數，取1×10-6到1×10-7孔兩孔平均值得出LV-IL-24病毒滴度為：7.25×107PFU/mL；同法測空病毒（LV-EGFP）滴度為8.12×107PFU/mL。

2.5 hBMSCs培養及鑒定 常規復蘇hBMSCs后約7 d到達90%融合，細胞的排列呈典型的漩渦樣，單個細胞呈典型紡錘型。經1:3比例傳代之后，細胞經3 d-4 d培養可以達到融合90%以上并適于再次傳代。流式細胞術分析結果顯示：hBMSCs均一性可達95%以上，hBMSCs高表達CD29、CD90，不表達DCD34、CD4（圖4）。

2.6 慢病毒載體轉導純化后hBMSCs綠色熒光觀察 慢病毒（LV-IL-24, LV-EGFP）轉染hBMSCs 72 h后，熒光顯微鏡下觀察到部分細胞表達綠色熒光。7 d后，鏡下可見綠色熒光細胞明顯增多，此時開始加入嘌呤霉素進行篩選，維持時間為7 d-10 d，期間細胞常規傳代，篩選結束后，即可得到攜帶慢病毒載體的綠色熒光細胞群（圖5）。

2.7 轉導純化后的hBMSCs的鑒定分析 qPCR檢測結果：hBMSCs組與hBMSCs-EGFP組可檢測到IL-24 mRNA少量表達，而hBMSCs-IL-24組可檢測到IL-24 mRNA明顯表達（P＜0.05）（圖6）。ELISA檢測結果：hBMSCs組與hBMSCs-EGFP組中幾乎檢測不到IL-24的濃度水平， hBMSCs-IL-24組中IL-24的濃度可到達40 μg/L，表明IL-24基因成功轉入到hBMSCs中。

3 討論

hBMSCs是具有多向分化潛能的干細胞，在體外能貼壁培養和大量擴增，hBMSCs屬成體干細胞，不僅可以向中胚層分化，在特定條件下，還能實現跨系統分化[8,9]，其植入體內無免疫排斥反應，并且能廣泛遷移，易于組織整合而發揮功能，都提示其在基因治療中可能成為非常有價值的運載細胞[10-12]。而且多項研究[1,13]表明，hBMSCs在體內有向腫瘤微環境趨向轉移的特性。將hBMSCs作為細胞載體開展腫瘤的基因治療是目前研究的熱點之一。

慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種[14]，可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源基因高效整合進宿主細胞基因組中，外源基因可在細胞內長期穩定表達。應用Gateway技術構建慢病毒載體已得到廣泛應用[15]，明顯簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，避免了假陽性的出現，使基因克隆更加方便易行。

圖1 入門克隆PCR鑒定結果Fig1 PCR identification results of entry clone

圖2 表達克隆PCR鑒定結果Fig2 PCR identification results of expression cloning

圖3 轉染72 h的293FT細胞綠色熒光Fig3 The green fluorescent of 293 FT cells after transfection for 72 h

圖4 人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）表面抗原標志Fig4 Surface antigen mark of hBMSCs

圖5 慢病毒轉導純化后hBMSCs的綠色熒光表達情況Fig5 The green fluorescent after lentivirus transducs hBMSCs

圖6 qPCR檢測IL-24 mRNA表達。*: P＜0.05Fig6 Expression of IL-24 mRNA detected by qPCR. *: P＜0.05

hBMSCs具有取材方便、體外易培養、強大的遷移能力及高效安全的外源基因表達能力等優點，故被認為是組織工程和基因工程理想的靶細胞[16,17]。選擇構建以慢病毒為載體的表達系統，對于較難轉染的干細胞，能明顯提高目的基因轉導效率，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達[18]。本實驗利用Gateway技術成功構建了慢病毒表達載體（pLVpuro/EF1α-IL-24-IRES-EGFP），將其包裝成慢病毒，同時將攜帶有目的基因的慢病毒成功轉導hBMSCs，編碼出來的綠色熒光蛋白和目的基因蛋白不是融合蛋白，而是各具獨立空間結構和生理活性，有利于目的基因蛋白的表達鑒定及定位追蹤[19]，同時為利用干細胞作為細胞載體攜帶治療基因或藥物靶向治療腫瘤提供新的理論依據。