CRABPII和E-FABP在非小細胞肺癌中的表達及其意義

劉倩 王世鳳 徐緩 張尚福

肺癌對人類健康的威脅日益嚴重，目前肺癌患者的5年生存率僅為15.6%[1]，深入研究肺癌的分子生物學特征對肺癌的早期診斷、治療及改善預后具有重要意義。最新研究[2]顯示，細胞視黃酸結合蛋白（cellular retinoic acid-binding protein II, CRABPII）和表皮型脂肪酸結合蛋白（epidermal fatty acid-binding protein, E-FABP）作為維甲酸（retinoic acid, RA）的轉運蛋白，將RA從細胞質轉運至細胞核，分別與兩種不同的核受體－－維甲酸受體（retinoic acid receptor, RAR）和過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ（peroxisome proliferator-activated receptor β/δ, PPARβ/δ）相互作用，在RA信號通路上發揮不同的作用，從正反兩方面影響細胞的增殖和凋亡。本實驗利用組織芯片技術和免疫組織化學染色檢測CRABPII和E-FABP在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）原發癌組織及其淋巴結轉移癌組織中的表達情況，探討兩者在NSCLC中表達的意義及其與NSCLC發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學華西醫院1998年1月-2003年12月手術切除、臨床資料完整和尚有石蠟標本的原發性NSCLC 287例，其中伴有轉移143例，實際收集到其淋巴結轉移灶103例。另取54例正常肺組織作為對照。287例NSCLC標本均經切片、HE染色，明確病理診斷（2003年WHO肺腫瘤組織學分類標準）。其中，男性230例，女性57例，男:女為4.04:1。發病年齡35歲-82歲，中位年齡61歲。鱗狀細胞癌133例，腺癌126例，腺鱗癌28例；高分化癌13例，中分化癌144例，低分化癌102例，未包括腺鱗癌。根據TNM分期，I期93例，II期61例，III期108例，IV期25例（2009年肺癌國際分期修訂版）。患者截止術前均未行放療或化療。隨訪時間0.06個月-97+個月，平均隨訪時間37個月，中位隨訪時間35個月。生存期的計算從手術日期起到隨訪日期或由于復發、轉移而死亡的日期為止。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作 選擇所需病例存檔蠟塊，根據HE染色切片進行形態學觀察，確定具有代表性的病變部位（避開出血、壞死、明顯炎細胞浸潤及纖維化區域）后在組織切片和相應石蠟組織塊上標志。將市售石蠟溶化后，注入模具內，制取大小為40 mm×30 mm×10 mm的載體蠟塊。在載體石蠟上用組織芯片制備儀的打孔針打出間距為1.5 mm，直徑為1.0 mm-1.2 mm，深度為4 mm的孔，設計成9×7陣列。用采樣針從已標志好的組織中獲取直徑為1.0 mm-1.2 mm的組織塊并將其壓入已打好孔的載體石蠟中。NSCLC原發癌、淋巴結轉移癌與正常肺組織隨機排列，左上角留一空白孔作為定位標識。每例腫瘤組織取3個-5個點，每例正常肺組織取3個點。

1.2.2 免疫組織化學染色試劑及方法羊抗人CRABPII多克隆抗體和大鼠抗人E-FABP單克隆抗體分別購自美國Stata Cruze和R&D公司。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。CRABPII和E-FABP一抗的工作稀釋濃度分別為1:400和1:200。本實驗采用SP法作免疫組織化學染色，具體步驟嚴格按照產品說明書進行。分別用正常乳腺組織和銀屑病皮膚組織作為CRABPII和E-FABP的陽性對照，以0.01 mol/L PBS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 CRABPII和E-FABP均以細胞質或/和細胞核呈黃色顆粒為陽性。高倍鏡下隨機選取10個視野共記錄1,000個陽性細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。①按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細胞率評分：0分為＜5%；1分為5%-＜25%；2分為25%-＜50%；3分為50%-＜75%；4分為≥75%。取①、②兩項評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1分-4分為弱陽性（+）；5分-8分為中等強度陽性（++）；≥9分為強陽性（+++）。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 16.00軟件包進行統計學分析。分類資料采用χ2檢驗；采用Spearman等級相關分析進行相關性分析；應用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，差異顯著性檢驗采用對數秩檢驗（Log-rank test）；Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRABPII和E-FABP在正常肺組織、NSCLC原發癌組織及其淋巴結轉移癌組織中的表達 在正常肺組織中，CRABPII均呈陰性表達（圖1）；E-FABP的陽性表達見于II型肺泡上皮細胞和部分支氣管腺體（圖2）。CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中表達程度各異（圖1、圖2）。

CRABPII在NSCLC原發癌組織和淋巴結轉移癌組織中的陽性表達率分別為39.0%和33.0%，其差異無統計學意義（χ2=1.171, P=0.279＞0.05）。E-FABP在正常肺組織、NSCLC原發癌組織和淋巴結轉移癌組織中的陽性表達率分別為24.1%、58.2%和19.4%，E-FABP在NSCLC原發癌組織中的陽性表達率分別高于正常肺組織（χ2=21.223,P＜0.001）和淋巴結轉移癌組織（χ2=45.651, P＜0.001）（表1）。

2.2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 在NSCLC原發癌組織中，CRABPII的表達與患者的性別、腫瘤的有無轉移以及TNM分期有關（P＜0.05）。CRABPII在女性患者中的陽性表達率高于男性患者；在伴有癌轉移的NSCLC中的陽性表達率低于不伴有轉移的NSCLC；TNM分期越晚，CRABPII的陽性表達率越低。E-FABP的表達與腫瘤的病理分級和有無轉移有關（P＜0.05）。E-FABP在不同病理分級NSCLC中的陽性表達率不全相同（χ2=15.014,P=0.001＜0.05)；進一步兩兩比較發現，E-FABP在中分化癌中的陽性表達率高于高、低分化癌（χ2=14.565,P＜0.001）；在高分化癌與低分化癌之間的表達差異無統計學意義（χ2=0.441, P=0.507＞0.05）。E-FABP在伴有癌轉移的NSCLC中的陽性表達率高于不伴有癌轉移的NSCLC（表2）。

2.3 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中表達的關系

2.3.1 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的表達比較 在NSCLC原發癌中，CRABPII和E-FABP的表達在（-）、（+）、（++）、（+++）中的分布不同，E-FABP的陽性表達較CRABPII占優勢，其差異有統計學意義（χ2=40.090, P＜0.001）（表3）。

圖1 CRABPII在正常支氣管粘膜上皮（A）、肺泡上皮（B）及鱗狀細胞癌（C）、腺癌（D）中的表達（A,B: SP, ×400; C,D: SP, ×200）Fig1 Expressions of CRABPII in normal bronchial epithelium (A), alveolar epithelium (B), squamous cell carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) (A,B:SP, ×400; C,D: SP, ×200)

圖2 E-FABP在正常支氣管粘膜上皮（A）、肺泡上皮（B）及鱗狀細胞癌（C）、腺癌（D）中的表達（A,B: SP, ×400; C,D: SP, ×200）Fig2 Expression of E-FABP in normal bronchial epithelium (A), alveolar epithelium (B), squamous cell carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) (A,B:SP, ×400; C,D: SP, ×200)

表 1 CRABPII和E-FABP在正常肺組織、非小細胞肺癌原發癌組織及淋巴結轉移癌組織中的表達Tab 1 Expression of CRABPII and E-FABP in normal lung tissues, non-small cell lung cancer (NSCLC) primary lesions and metastasis lymph node

表 2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌中的表達與臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between expression of CRABPII and E-FABP and clinicopathological characteristics of NSCLC

表 3 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的表達關系Tab 3 Relationship between expression of CRABPII and E-FABP in primary NSCLC lesions

2.3.2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的差異性表達與各臨床病理學特征的關系 在NSCLC原發癌組織中，219例E-FABP的表達強于或相當于CRABPII（E-FABP≥CRABPII），即E-FABP和CRABPII的表達強度呈-/-、+/-、+/+、++/-、++/+、++/++、+++/-、+++/+、+++/++、+++/+++；68例E-FABP的表達弱于CRABPII（E-FABP＜CRABPII），即E-FABP和CRABPII的表達強度呈-/+、+/++、-/++、++/+++、+/+++、-/+++。CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的差異性表達與腫瘤的大小、有無轉移、TNM分期和病理分級有關（P＜0.05）。NSCLC腫瘤愈大、伴有轉移、TNM分期愈晚，E-FABP的表達愈占優勢。E-FABP表達強于或相當于CRABPII的在不同病理分級NSCLC中的構成比不全相同（χ2=6.655，P=0.036＜0.05）；進一步兩兩比較發現，高分化癌中E-FABP的表達強于或相當于CRABPII的構成比低于中、低分化癌（χ2=4.251, P=0.039＜0.05），中分化癌和低分化癌中其構成比的差異無統計學意義（χ2=2.501,P=0.114＞0.05）（表4）。

2.4 CRABPII與E-FABP在NSCLC原發癌組織中表達的相關性 Spearman非參數等級相關分析顯示，CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌組織中的表達無相關性（r=-0.051, P=0.386＞0.05）。

2.5 CRABPII與E-FABP的表達與預后的關系

2.5.1 Kaplan-Meier單因素生存分析 將CRABPII和E-FABP的表達分為陰性和陽性兩組；CRABPII與E-FABP的表達差異分為E-FABP的表達強于或相當于CRABPII組（E-FABP≥CRABPII）和E-FABP的表達弱于CRABPII組（E-FABP＜CRABPII）。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者生存曲線，Log-rank檢驗不同樣本的生存曲線，結果顯示：CRABPII陽性表達組NSCLC患者的生存率高于陰性表達組（χ2=6.443, P=0.011＜0.05）（圖3）；E-FABP不同表達水平NSCLC患者的生存率差異無統計學意義（χ2=1.664, P=0.197＞0.05）（圖4）；E-FABP表達強于或相當于CRABPII組的生存率低于E-FABP表達弱于CRABPII組的患者（χ2=8.632, P=0.003＜0.05）（圖5）。

2.5.2 Cox比例風險回歸模型分析 通過Cox比例風險回歸模型進行多因素預后分析，包括NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、組織學類型、病理分級、TNM分期、有無癌轉移、CRABPII和E-FABP的表達以及CRABPII與E-FABP的差異性表達。采用前向逐步法，在α=0.05的水平上，腫瘤的大小（P=0.024）、有無癌轉移（P=0.040）和TNM分期（P=0.001）這3個因素被篩入Cox模型內（表5），是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。NSCLC的腫瘤直徑＞3 cm的患者其死亡風險是直徑≤3 cm患者的1.448倍；伴有癌轉移的患者其死亡風險較不伴有癌轉移患者增加了64%；隨著TNM分期的遞增，患者的死亡風險依次增加53.4%。

表 4 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發癌中的差異性表達與各臨床病理特征的關系Tab 4 Relationship between difference expression of CRABPII and E-FABP and clinicopathological characteristics of NSCLC

3 討論

圖3 CRABPII陰性表達組和陽性表達組NSCLC患者的生存曲線Fig3 The survival curves of NSCLC patients with negative and positive expression of CRABPII

圖4 E-FABP陰性表達組和陽性表達組NSCLC患者的生存曲線Fig4 The survival curves of NSCLC patients with negative and positive expression of E-FABP

圖5 CRABPII與E-FABP差異性表達的NSCLC患者生存曲線Fig5 The survival curves of NSCLC patients with difference expression between CRABPII and E-FABP

表 5 Cox回歸模型篩選的影響NSCLC患者的危險因素Tab 5 The risk factors of NSCLC patients selected by Cox regression model

細胞視黃酸結合蛋白（cellular retinoic acid-binding proteins, CRABPs）是調節RA和RAR之間相互作用的重要物質，包括CRABPI和CRABPII。CRABPI通過影響與RA代謝有關的酶從而調節RA的代謝，CRABPII與RA的轉錄活性有關[3]。CRABPII作為RA的轉運蛋白，其主要作用是結合RA，并將RA轉運至細胞核，與RAR相互作用，調節轉錄，從而發揮RA調節細胞分化[4]、調控細胞周期[5]、誘導細胞凋亡[6]，進而抑制細胞生長的作用。CRABPII基因在腫瘤中和正常組織中的表達存在差異，其在精囊腺中的高表達被認為可能是精囊腺不易發生腫瘤的原因[7]。在乳腺癌小鼠動物模型中，CRABPII能抑制腫瘤細胞的生長和轉移[8]。本研究發現在NSCLC原發癌中，CRABPII的表達與患者的性別、腫瘤有無轉移和TNM分期有關。CRABPII在女性患者中的陽性表達率高于男性患者，這可能與雌激素有關，雌激素能誘導并調節CRABPII的表達[9]。CRABPII的表達還與腫瘤細胞的侵襲能力有關，CRABPII在伴有轉移的NSCLC中的陽性表達率低于無轉移的NSCLC；而且CRABPII的表達隨TNM分期的上升而下降的趨勢，并且與NSCLC患者的預后呈負相關。本實驗結果提示，在NSCLC中，CRABPII可能具有抑制腫瘤細胞的轉移和腫瘤演進的作用，尚有待進一步深入研究證實。

E-FABP與脂肪酸的攝取、轉運和代謝有關，并且作為信號分子參與調節細胞的分化和基因的表達[10]。近年來多項研究發現，很多在腫瘤細胞和正常細胞中差異性表達的基因，其表達的增加或缺失與腫瘤的發生和演進有關，而E-FABP就是這樣一種基因[11,12]。在肺鱗狀細胞癌[13]、肝細胞癌[14]、前列腺癌[15]中，E-FABP均較相應正常組織高表達。另外，E-FABP基因是一個腫瘤轉移誘導基因，能夠誘導腫瘤細胞發生轉移[16]。E-FABP不僅與腫瘤的發生有關，而且還參與腫瘤的演進。本實驗結果顯示，在正常肺組織中，E-FABP的陽性表達見于II型肺泡上皮細胞和部分支氣管腺體。E-FABP與表面活性物質的合成有關，具有維持表面活性物質平衡的作用[17]。在NSCLC原發癌組織中，E-FABP的表達與腫瘤的有無轉移和病理分級有關。E-FABP在NSCLC組織中的陽性表達率高于正常肺組織，提示E-FABP可能參與了NSCLC的發生。E-FABP在有轉移的NSCLC中陽性表達率高于無轉移的NSCLC，其在NSCLC原發癌組織中的陽性表達率高于淋巴結轉移癌組織。Uma等[18]在舌鱗狀細胞癌中也發現，E-FABP mRNA在原發癌組織中的表達是其淋巴結轉移癌組織中的4倍，提示在淋巴結轉移癌組織中腫瘤細胞在一定程度上丟失了表達E-FABP的能力。E-FABP能促進腫瘤細胞的轉移，但是在淋巴結轉移癌組織中的表達卻有所下降，E-FABP在轉移過程中的具體調節機制有待更深入的研究。以上結果提示：E-FABP不僅參與了NSCLC的發生，還可能與NSCLC腫瘤細胞的侵襲能力有關，即能促進NSCLC腫瘤細胞的轉移。

CRABPII和E-FABP作為RA的轉運蛋白，調節RA與兩種不同的核受體-RAR和PPARβ/δ相互作用。CRABPII將RA轉運至RAR，抑制細胞生長；而E-FABP將RA轉運至PPARβ/δ，促進細胞增殖。在不同的細胞中兩種結合蛋白表達水平的不同，也會引起受RA調節的相關基因表達的不同，進而引起對RA不同的效應[2]。CRABPII/E-FABP呈高比例時，主要通過RAR通路，發揮促凋亡作用；相反，當CRABPII/E-FABP呈低比例時，則主要通過PPARβ/δ通路，發揮促增殖的作用。兩種受體，RAR和PPARβ/δ可以存在于同一種細胞或者同一細胞中，細胞中CRABPII和E-FABP的比例關系決定RA激活何種核受體，影響細胞的增殖和凋亡。

本實驗研究發現，在NSCLC原發癌組織中，CRABPII和E-FABP的表達在（-）、（+）、（++）、（+++）中的分布不同，E-FABP在NSCLC原發癌組織中的陽性表達較CRABPII占優勢。CRABPII和E-FABP的差異性表達與腫瘤的大小、病理分級、有無癌轉移和TNM分期有關，并影響NSCLC患者的預后，提示在NSCLC中，E-FABP的表達愈占優勢，瘤體愈大，腫瘤發生轉移的幾率愈大，臨床分期愈晚，患者的預后愈差。

雖然RA的抑制細胞生長的作用已經明確，但其在腫瘤治療上卻往往因為明顯的藥物細胞毒性和腫瘤發生發展過程中形成的RA抵抗而受限[19]。E-FABP/PPARβ/δ通路的發現也為RA應用于腫瘤治療提供了新的啟示。在CRABPII存在的情況下，生理濃度的RA足以發揮抑制細胞增殖的作用，外源性的RA并不會增強此作用；而缺乏CRABPII，即使RA的濃度很高，RAR也不會被活化[20]。那么，在生理濃度RA的作用下，細胞中CRABPII/E-FABP的比例就成了影響細胞增殖的焦點。據文獻報道，13-順式-維甲酸、全反式維甲酸能逆轉或者阻止癌前病變支氣管粘膜鱗狀上皮化生的進展，維甲酸類化合物作為肺癌化學預防藥物的潛在價值已備受關注[21]；而體內外實驗均提示E-FABP的下調能抑制細胞的致瘤和轉移能力[15,22]。綜上，CRABPII、E-FABP以及CRABPII/E-FABP的比例關系有望成為肺癌個性化靶向治療研究的新方向。