小球藻多糖體外免疫調節活性研究

王凌，孫利芹，周妍

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005）

小球藻（Chlorellasp.）是一類普生性單細胞綠藻，含有豐富的蛋白質、多糖、脂質、葉綠素、維生素、微量元素和一些生物活性代謝產物，有“藥物藻類”之美譽[1]。有研究表明，小球藻干粉或其提取物能使免疫低下小鼠的細胞免疫功能有所恢復[2-4]。Tanaka等報道[3]小球藻提取物在小鼠抗腫瘤MethA的作用中，需要抑制性T淋巴細胞的參與，即通過淋巴器官中T細胞的活化，并增強腫瘤部位T細胞的補充來抑制腫瘤轉移。Hasegawa等[5]研究給予白血病小鼠小球藻后，可恢復其對單核增生李斯特氏菌的清除力，感染部位的T細胞數目增加。

多糖是小球藻提取液中主要的活性成分之一，在抗腫瘤、抗病源菌、抗病毒方面具有顯著效果[6]。施瑛、盛建春等[7-8]針對蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖進行了體外抗腫瘤和免疫功能的研究，而關于普生小球藻多糖對正常小鼠細胞免疫系統影響的報道較少。以普生小球藻為研究對象，以其多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖，腹腔巨噬細胞增殖、吞噬中性紅及釋放NO能力的影響為指標，詳細考察了小球藻多糖對健康小鼠細胞免疫系統的影響，以期為小球藻及其多糖作為功能食品基料的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

小球藻多糖由小球藻藻泥經細胞破碎，熱水提取，Sevag法去蛋白，乙醇沉淀，透析，冷凍干燥得到多糖干粉。精密稱取多糖干粉4 mg，溶于20 mL的RPMI1640培養基中，得濃度為200 μg/mL的多糖溶液，用直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌備用。使用時依次倍比稀釋可得濃度為 100，50，25，12.5 μg/mL的溶液。

1.2 試劑及儀器

刀豆蛋白 A（ConA）、脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS） 均為 Sigma公司；RPMI－1640 培養基：Gibco公司；新生小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；Synergy HT型酶聯免疫檢測儀：美國Bio－TEK公司。

1.3 實驗動物及細胞株

清潔級昆明種小鼠，雌雄不限，體重18 g～22 g，山東綠葉制藥有限公司（許可證號：SYXK（魯）20030020）。小鼠巨噬細胞樣細胞株RAW264.7（ATCC TIB－71），上海細胞研究所提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠單核腹腔巨噬細胞Raw264.7吞噬中性紅實驗

取處于對數生長期的小鼠單核－巨噬細胞RAW264.7，胰酶消化收集細胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液調整細胞濃度為1×106/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，置 37 ℃、5%CO2培養 2 h，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗3次，洗去未貼壁的細胞，補充新鮮培養液，加入用培養液稀釋的不同濃度的小球藻多糖 100 μL/孔，并以 100 μL LPS（2 μg/mL）、培養液作陽性和陰性對照；培養24 h后棄上清，每孔加入0.08%中性紅溶液100 μL，繼續培養20 min后，傾上清，PBS洗3遍，每孔加入細胞溶解液0.2 mL，室溫下靜置過夜，待細胞溶解后，即在酶聯免疫檢測儀上測540 nm處的吸光度。

1.4.2 小鼠單核腹腔巨噬細胞Raw264.7釋放NO能力的檢測

參照1.4.1制備巨噬細胞懸液，調整細胞濃度為2.5×105/mL，于 96 孔板接種 100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養24 h。加藥同上。繼續培養48 h后，從每個孔取50 μL培養上清液到一個新的96孔板中，加入等量的Griess試劑，室溫反應10 min，30 min之內在520 nm～550 nm之間（540 nm）測定吸光度。根據標準曲線計算NO的含量。實驗重復3次。

1.4.3 小鼠單核腹腔巨噬細胞Raw264.7增殖能力的測定

參照1.4.1，加藥培養24 h后，SRB法檢測[8]。

1.4.4 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗

無菌取脾，制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為 8×106個/mL～10×106個/mL。按照 1.4.1 加藥，陽性對照為ConA 100 μL/孔（10μg/mL），置 5%CO2，37 ℃培養48 h。培養結束前4 h，MTT法檢測[9]。

1.4.5 數據處理

所有數據均以均值±標準差表示。t檢驗采用SPSS11.5統計軟件包完成，以P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結果與討論

2.1 小球藻多糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響

巨噬細胞作為機體免疫系統的重要組成成分，在體液免疫和細胞免疫中發揮中心作用。它可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細胞，還可分泌白介素等細胞因子，進而發揮抗病毒、抗腫瘤作用[10]。表1數據顯示，小球藻多糖在12.5μg/mL～200μg/mL

表1 小球藻多糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅活性的影響（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

表1 小球藻多糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅活性的影響（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

注：與對照組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

實驗組給藥劑量/（μg/mL）吸光度OD540空白對照組 － 0.756±0.007脂多糖（LPS） 2 1.168±0.013**200 1.155±0.021**100 1.178±0.009**50 1.406±0.074**25 1.032±0.039*12.5 1.095±0.009**小球藻多糖

濃度范圍內，均可顯著或極顯著促進巨噬細胞吞噬中性紅的作用（P＜0.05或 P＜0.01），濃度為 50 μg/mL 時，對巨噬細胞吞噬功能的增強作用最強，比空白對照組高出1.86倍，是陽性對照組（LPS）的1.2倍，隨后促進作用有所下降。一般認為，巨噬細胞的代謝狀況和其吞噬能力直接相關，代謝旺盛，則說明巨噬細胞的吞噬能力增強；代謝減弱，則吞噬功能下降。因此本實驗數據表明小球藻多糖能夠促進機體巨噬細胞的代謝能力。

2.2 小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產生NO的影響

在免疫細胞中NO是由誘導型NO合酶催化生成的，正常情況下，哺乳動物體內可連續產生少量NO，細胞因子刺激免疫細胞可產生大量NO。NO在免疫系統中作為信號轉導的一種重要介質而起作用[10]。不同濃度小球藻多糖對腹腔巨噬細胞產生NO的影響如表2 所示。可以看出，在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內，小球藻多糖可明顯地促進小鼠腹腔巨噬細胞產生NO，并呈一定的劑量的依賴性，隨著濃度的升高，誘生NO的能力增強，在濃度為100 μg/mL時，其NO濃度是空白對照組的1.96倍。但是與陽性對照組脂多糖相比，促進作用稍弱。表明小球藻多糖可通過誘導和激活腹腔巨噬細胞來產生NO，從而達到增強細胞免疫能力的目的。

表2 小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產生NO的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

表2 小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產生NO的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

注：與對照組相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

實驗組給藥劑量/（μg/mL）NO濃度/（μmol/mL）空白對照組 － 3.598±0.509脂多糖（LPS） 2 8.905±0.385**200 7.408±0.763**100 7.068±1.503**50 6.728±0.385**25 6.116±0.976**12.5 4.823±0.787*小球藻多糖

2.3 小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響

小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響見圖1。

圖1 小球藻多糖對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響Fig.1 Effect of Chlorella polysaccharides on the proliferation of mouse peritoneal macrophage（±s，n=9）

在 12.5 μg/mL～100 μg/mL 的濃度范圍內，小球藻多糖可顯著地促進小鼠腹腔巨噬細胞增殖，與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01）。在 50 μg/mL 時，促進作用最強。隨后隨濃度繼續增加，促進作用減弱，至200 μg/mL時，與空白對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05）LPS在2 μg/mL濃度下可極顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞的增殖（P＜0.01）。這一結果與2.1中小球藻多糖對巨噬細胞吞噬中性紅能力影響結果一致，進一步證明了巨噬細胞代謝功能與吞噬能力這一關系。

2.4 小球藻多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

脾臟是機體內重要的免疫器官，富含T、B淋巴細胞，加之其易于分離，是體外試驗中淋巴細胞的重要來源。測定淋巴細胞體外增殖反應是檢測淋巴細胞功能的常用方法[10－11]。本研究中圖2數據顯示，低濃度（12.5 μg/mL）的小球藻多糖與空白對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05），在 25 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內，小球藻多糖可極顯著地刺激并促進脾淋巴細胞的增殖（P＜0.01），且隨多糖濃度提高，刺激作用不斷增強，表明小球藻多糖對脾淋巴細胞增殖活性呈現明顯的劑量依賴性。

圖2 小球藻多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Chlorella polysaccharides on the spleen lymphopoiesis of mouse（±s，n=9）

3 結論

小球藻多糖在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內，對巨噬細胞吞噬中性紅有明顯的促進作用，并可顯著地促進小鼠腹腔巨噬細胞增殖，二者都在50μg/mL時促進作用達最大值；實驗濃度范圍內，小球藻多糖可明顯地促進小鼠腹腔巨噬細胞產生NO，并呈一定的劑量的依賴性，在濃度為100 μg/mL時，其NO濃度是空白對照組的1.96倍，但是與陽性對照組脂多糖相比，促進作用稍弱；在 25 μg/mL～200 μg/mL 的濃度范圍內，小球藻多糖可極顯著地刺激并促進脾淋巴細胞的增殖（P＜0.01），且隨多糖濃度提高，作用增強，表明小球藻多糖對脾淋巴細胞增殖活性呈現明顯的劑量依賴性。本次研究結果顯示小球藻多糖在機體免疫調節等方面可能有重要作用和良好的應用前景。

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