牛蒡根提取物不同組分體外腫瘤細胞毒作用

沈洪昇，趙秀梅，張富庚，胡人杰，史鵬程，顧娜

（天津市醫藥科學研究所，天津 300020）

牛蒡（Arctium lappa L.）是菊科牛蒡屬植物。原產于我國，以野生為主，分布從東北至西南[1]。公元940年前后牛蒡傳入日本，并被培養成優良品種，現在日本人把牛蒡根奉為營養和保健價值極佳的高檔蔬菜。近年來的研究表明，牛蒡根具有抗菌、抗氧化和降血脂等方面的生物活性[2-3]。筆者在之前的實驗中曾采用溶劑法對牛蒡根進行了初步的提取分離，得到的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等4個不同極性提取物，在體外抗腫瘤活性篩選中，表現出明確的細胞毒作用，尤以石油醚和氯仿提取物活性最佳[4]。本研究采用硅膠柱層析法對石油醚和氯仿提取物進一步提取分離，MTT法比色法對這些洗脫組分進行體外抗腫瘤活性的測定，從而確定了牛蒡根中抗腫瘤有效成分的所在部位，為牛蒡根的綜合利用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

昆明種小鼠，體重18 g～22 g，雄性，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 瘤株

人的乳腺癌細胞株MCF-7、小鼠肝癌Hep A腹水型和肉瘤S180腹水型，由天津市醫藥科學研究所瘤源室提供。

1.2 藥品與試劑

牛蒡根，市售，購自津工超市。切片曬干經粉碎機粉碎為干粉。

RPMI1640培養液：GIBCO公司，小牛血清：杭州四季青工程材料有限公司，MTT：北京欣經科生物技術有限公司。無水乙醇、正丁醇、石油醚（30－60℃）、氯仿、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

CO2孵育箱：TyTe公司；酶標儀：Labsystems Dragon公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

1.4.1.1 牛蒡根石油醚、氯仿提取物的制備

牛蒡根干粉95%乙醇回流提取后，減壓回收溶劑，浸膏加適量水使混懸，依次以石油醚、氯仿萃取。將各萃取液分別濃縮，得石油醚、氯仿提取物。

1.4.1.2 石油醚提取物硅膠柱層析分離組分的制備

100目～200目硅膠玻璃管柱濕法裝柱，上樣3 g；分別用氯仿；氯仿：甲醇 9 ∶1；氯仿：甲醇 8 ∶2；氯仿：甲醇7∶3過柱洗脫，最后甲醇沖柱。試驗過程中用10 mL試管接取洗脫樣品，每份5 mL。經TLC檢測，選取斑點集中的合并，減壓回收溶劑，將濃縮物再低溫真空干燥后，稱重并計算收率。

1.4.1.3 氯仿提取物硅膠柱層析分離組分的制備

100目～200目硅膠玻璃管柱濕法裝柱，上樣2 g；分別用氯仿 ∶甲醇8∶2、氯仿 ∶甲醇7∶3、氯仿 ∶甲醇2∶8洗脫，最后甲醇沖柱。試驗過程中用10 mL試管接取洗脫樣品，每份5 mL。經TLC檢測，選取斑點集中的合并，減壓回收溶劑。將濃縮物再低溫真空干燥后，稱重并計算收率。

1.4.2 樣品對體外培養腫瘤細胞生長的影響

1.4.2.1 待測樣品的配制

稱取牛蒡根層析物10 mg，加入含10%小牛血清RPMI 1640溶液2 mL，于超聲波儀中超聲5 min，使浸膏充分溶解或混懸，配制成5 mg/mL的儲備液。

精密吸取上述溶液適量，用含10%小牛血清的RPMI1640液配制成不同濃度的溶液。

1.4.2.2 細胞實驗過程[5]

取對數生長期MCF－7細胞，經0.25%胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI 1640液調整細胞濃度為1×105/mL，以每孔100 μL分別接種于96孔培養板中，培養24 h待細胞貼壁。另外再抽取荷瘤HepA及S180小鼠腹水，PBS洗滌2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀釋成1×106/mL單細胞懸液，分別接種于96孔培養板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同濃度的待測樣品液100 μL，每個濃度平行4孔，樣品設5個～8個濃度梯度組，對照組加入等體積含10%小牛血清的RPMI 1640培養液，使反應體積為 200 μL。37℃、5%CO2培養箱中培養72h后，每孔加入5mg/mLMTT液10μL，37℃溫育4 h，1 000 r/min離心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震蕩，于酶標儀570 nm處測吸光度（OD）值。按公式計算細胞生長抑制率。細胞存活率對劑量對數線性回歸計算IC50值。

抑制率（%）=（1－實驗組OD值/細胞對照OD值）×100%

2 結果

2.1 牛蒡根硅膠柱層析分離的實驗結果

牛蒡根石油醚提取物經柱層析后，得到3個種組分 S－1（黃色澄清油狀物，677.4 mg）、S－2（褐色粘稠物，908.9 mg）和 S－3（深棕色粘稠的，766.4 mg）。牛蒡根氯仿提取物經柱層析后，得到4個種組分L－1（淺棕色粘稠狀物質，138 mg）、L－2（淺棕色粉末，160 mg）、L－3（淺棕色粉末狀提取物，660 mg）和L－4（淺棕色粉末，309 mg）。不同層析物得率結果，具體見表1。

表1 牛蒡根石油醚和氯仿提取物硅膠柱層析洗脫成分的得率結果Table 1 The yield of elution components from petroleum ether and chloroform extract of Burdock root

2.2 牛蒡根柱層析物對體外培養腫瘤細胞生長的影響

由表2、表4中結果可以看出，牛蒡根各層析物S－1、S－2、S－3 和 L－1、L－2、L－3、L－4 在各濃度范圍內對MCF－7、Hep A和S180細胞的生長均表現出不同程度的抑制作用。對MCF－7細胞的IC50分別為832.3、76.24、＞500 μg/mL 和 131.31、147.01、315.95、＞500 μg/mL；對Hep A 細胞的 IC50分別為 398.42、97.97、253.04 μg/mL和 8.56、17.42、55.94、151.48 μg/mL；對 S180細胞的 IC50分 別 為 24.77、77.93、318.76 μg/mL 和 9.33、23.55、47.87、80.26μg/mL。相比較牛蒡根石油醚和氯仿提取物對三種細胞株的 IC50（222.59、59.07、52.86 μg/mL 和 265.93、76.80、73.62μg/mL）[4]，L－1 和 L－2 的細胞毒活性顯著增強，樣品的IC50至少降低了1.8倍以上。

表2 牛蒡根柱層析物對MCF-7細胞毒作用的結果Table 2 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on MCF-7 cell

表3 牛蒡根柱層析物對Hep A細胞毒作用的結果Table 3 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on Hep A cell

表4 牛蒡根柱層析物對S180細胞毒作用的結果Table 4 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on S180cell

3 討論

牛蒡在我國具有豐富的植物資源，除其果實牛蒡子作為我國的法定藥物外，其根、莖、葉均可作為草藥使用[6]。人們對牛蒡的研究已有數十年的歷史，研究目標主要集中于牛蒡子，其抗腫瘤成分及活性方面的研究已經比較深入 ，但對于牛蒡根的研究尚處于起步階段，認識有限。目前牛蒡根作為一種潛在的具有預防癌癥的保健蔬菜在日本受到歡迎，而且對植物藥開發愈來愈加重視的歐美國家則已經將牛蒡根作為主要的藥用部位來進行研究[9]。故進一步研究和評價牛蒡根的抗腫瘤作用，應該是非常有意義的一項工作。

本項研究中，筆者對有明確抗腫瘤活性的牛蒡根石油醚、氯仿提取物做進一步的柱層析分離后，得到的7個樣品。選用MCF－7和小鼠腫瘤S180、Hep A肝癌細胞，觀察各層析物對三種細胞的細胞毒活性的變化。結果，僅 S－1 對于 S180細胞、S－2對于 MCF－7 細胞較之粗提物，表現出較好的細胞毒活性。而其他的石油醚層析物其活性均有不同程度的下降。當氯仿提取物柱層析后，除L－4外，其他部位對三個細胞株的細胞毒活性都明顯增加，尤以L－1、L－2活性增加最為明顯。這就表明牛蒡根抗腫瘤活性部位應為氯仿層中分離的L－1、L－2。現代研究資料表明，牛蒡根中含有聚炔類化合物，此類化合物主要特點是除具有不飽和三鍵結構外，往往還含有烯的結構，因而具有抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性[10]。那么本實驗中所見牛蒡根的抗腫瘤生物活性，是否與其所含的“炔類化合物”相關，有待進一步考察。筆者將在今后的試驗中，通過植化的方法（生物活性跟蹤法）對L－1和L－2這兩部分做進一步的分離、純化，以期找到牛蒡根中明確的抗腫瘤活性成分。

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[1]丁景和.藥用植物學[M].上海:上海科學技術出版社,1985:215

[2]彌春霞,姜明,任玉蘭.野生牛蒡根提取物的抑菌作用研究[J].安徽農業科學,2010,38(33):18765－18767

[3]魏東.牛蒡抗氧化、降血脂保健功能研究[J].食品科學,2008,29(2):380－382

[4]趙秀梅,張富賡,沈洪升,等.牛蒡根4種提取物體外抗腫瘤活性的比較研究[J].中國藥房,2012,2(15):1351－1353

[5]尹桂豪,章程輝,史海明,等.糯米香茶的生物活性研究[J].食品研究與開發,2009,30(3):18－20

[6]江蘇新醫學院.中藥大辭典[J].上海:上海科學技術出版社,1977:431

[7]鄭云楓,彭國平.牛蒡的化學研究進展[J].時珍國醫國藥,2005,16(2):153－155

[8]米靖宇,宋純清.牛蒡子中木脂素類化合物的抗腫瘤及免疫活性[J].時珍國醫國藥,2002,13(3):168－169

[9]魏東,王連翠.牛蒡根的研究進展[J].安徽農業科學,2006,34(15):3716－3717

[10]趙秀梅,胡人杰.天然炔類化合物的研究現狀[J].天津藥學,2007,19(1):60－63