ARK5和基質金屬蛋白酶2在小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

陶 蓉，邱世超，侯成浩，李夢云，宿 超，李 慧，王云甲，史立宏，張寶剛，鄭世良

浸潤和轉移是惡性腫瘤重要的生物學特征之一，許多臨床醫生都關注到這一問題，并進行了不懈努力和探索，但針對惡性腫瘤的浸潤和轉移對策卻無明顯進展，目前其仍然是臨床治療失敗和死亡的主要原因。肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率已位居惡性腫瘤的第1位，并且仍呈上升趨勢。肺癌易發生浸潤和轉移，5年生存率遠低于其他惡性腫瘤。2003年由 Suzuki等［1］發現的 ARK5(AMPK －related protein kinase 5)又稱NUAK1，是AMPK亞家族的成員，是Akt的下游信號分子。Akt被認為在腫瘤細胞的侵襲中具有關鍵作用［2－4］。ARK5作為Akt的下游信號因子，也被認為是腫瘤浸潤和轉移相關蛋白。相關研究表明，ARK5在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌的浸潤、轉移中起到不同程度的作用［5－8］?；|金屬蛋白酶2(MMP－2) 是十分重要的促進腫瘤轉移和侵襲的因子，在相關的研究中證明ARK5能刺激MMP－2的表達并促進其分泌。目前，國內外對ARK5在肺癌中的臨床研究較少，尚未發現相關報道。所以ARK5在肺癌患者癌組織中的表達及其臨床作用的研究十分必要。本研究檢測ARK5和MMP－2在小細胞肺癌 (SCLC)患者癌組織中的表達情況，同時分析了ARK5和MMP－2與SCLC患者臨床病理特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2003年1月—2011年1月在濰坊市人民醫院、濰坊醫學院附屬醫院、第二人民醫院經纖維支氣管鏡、CT引導下經皮肺穿刺活檢、手術切除并經病理結果證實的SCLC患者106例的手術標本為SCLC組，其中男79例，女27例; ＜60歲54例，≥60歲52例;腫瘤直徑＜4 cm 60例，≥4 cm 46例;低分化21例，中分化70例，高分化15例;Ⅰ期54例，Ⅱ期16例，Ⅲ期32例，Ⅳ期4例;T1期+T2期80例，T3期+T4期26例;N0期72例，N1～3期34例。術前均未化療或放療，未給予CAPli等生物治療，取得標本后常規病理檢查，并明確診斷，且具備完整的臨床資料。另選取同時期其他疾病切除的肺組織標本40例為對照組，其中男29例，女11例; ＜60歲21例，≥60歲19例;病因:肺大皰18例，支氣管擴張13例，肺膿腫9例。兩組性別構成和年齡分布具有均衡性。

1.2 免疫組化檢測ARK5和MMP－2的表達 術后標本立即用10%甲醛固定，送達病理科，由病理科專門技術人員進行常規石蠟包埋、切片，每層切片厚度4 μm。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，應用免疫組化SP法 (免疫組化二抗SP試劑盒由北京中杉生物公司生產，兔抗人ARK5和MMP－2多克隆抗體由美國Sigma公司生產)由專人按照試劑說明書嚴格進行操作。

1.3 結果判斷 由兩位具有豐富經驗的病理科醫師閱片后共同決定。全部切片均采用雙盲法進行操作。發現細胞質呈淺黃色、黃色或棕黃色即可判斷為ARK5和MMP－2陽性表達。操作時，通常都是隨機選擇10個高倍鏡視野 (400倍)，每個視野連續計數100個細胞，共計數1 000個細胞。最后表達以染色強度和陽性細胞率的得分之和進行判斷:強染色記3分，中等染色記2分，弱染色記1分，無染色記0分;另一方面陽性細胞率＜5%記0分，5% ～25%記1分，26% ～50%記2分，＞50%記3分。每例患者各項得分做好記錄，再將上述兩項得分相加做出判斷結果:≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件包進行分析。計數資料采用 χ2檢驗或 Fisher精確檢驗;相關分析采用Spearman秩相關分析;單因素生存分析采用Kaplan－Meier生存曲線和Log－rank檢驗;多因素生存分析采用Cox多因素分析模型。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARK5和MMP－2檢測結果 電子顯微鏡高倍鏡視野顯示，SCLC組織中，ARK5主要定位于細胞質，正常肺組織中不表達;MMP－2主要定位于細胞質和細胞膜，正常肺組織中主要為陰性表達，間質細胞有少量表達 (見圖1)。SCLC組ARK5和MMP－2陽性率分別為67.9%(72/106)和65.1%(69/106)，對照組中分別為5.0% (2/40)和7.5% (3/40)，差異均有統計學意義 (χ2值分別為46.004和38.540，P＜0.05)。

2.2 ARK5和MMP－2的表達與SCLC患者臨床病理特征的關系 ARK5和MMP－2的陽性率與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期有關 (P＜0.05)，而與性別、年齡無關 (P＞0.05，見表1)。

表1 ARK5和MMP－2的表達與SCLC患者臨床病理特征的關系Table 1 Expression of ARK5 and MMP－2 in SCLC patients and its correlation with the clinicopathologic features

2.3 ARK5和MMP－2相關性分析 經Spearman秩相關分析發現，SCLC癌組織中ARK5與MMP－2呈正相關 (r=0.878，P＜0.001)。

2.4 生存分析 Kaplan－Meier生存曲線顯示，ARK5陽性組5年生存率為12.9%，陰性組為59.6%，差異有統計學意義(χ2=30.077，P＜0.001);MMP－2陽性組5年生存率為16.3%，陰性組為62.3%，差異有統計學意義 (χ2=24.405，P＜0.001，見圖2)。

注:A:正常肺組織ARK5的表達，B:SCLC癌組織ARK5的表達，C:正常肺組織MMP－2的表達，D:SCLC癌組織MMP－2的表達

圖2 Kaplan－Meier累計生存時間曲線分析Figure 2 Kaplan－Meier cumulative survival time curve analysis

2.5 Cox多因素回歸分析 以SCLC患者死亡為因變量，以ARK5、MMP－2、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期為自變量 (見表2)，納入Cox多因素分析模型，結果顯示，ARK5、分化程度、腫瘤分期與SCLC患者的預后差異有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表2 SCLC患者預后影響因素的賦值Table 2 Assignment of factors affecting the prognosis of SCLC patients

表3 SCLC患者預后影響因素的Cox多因素回歸分析Table 3 Cox variables of factors affecting the prognosis of SCLC patients

3 討論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，影響肺癌患者預后的最根本的原因是肺癌細胞的侵襲與轉移，這也是困擾臨床醫生的主要問題，因此關于肺癌細胞的侵襲與轉移的研究得到了許多臨床醫生的廣泛重視。雖然，近年來對肺癌發展和演進過程中的癌癥相關基因研究進展較快，但肺癌確切的發病原因、發病機制，尤其是相關基因具體作用以及浸潤和轉移的機制仍不明確。

ARK5是AMP激活蛋白酶 (AMPK)亞家族的成員，是Akt的下游信號分子。文獻報道，ARK5在促進腫瘤的發生和抑制腫瘤細胞的凋亡過程中起到一定作用［9］;另外研究表明，Akt－ARK5途徑與腫瘤惡性程度及其浸潤和轉移都有密切關系［9－10］。相關研究已表明，ARK5不但在乳腺癌、卵巢癌的浸潤、轉移中起到不同程度的作用，而且在胰腺癌、直腸癌的浸潤、轉移中也起到不同程度的作用［5－8］，但其在SCLC中的作用尚未見報道。本研究結果顯示，ARK5和MMP－2的異常表達均與SCLC的腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤分期密切相關，這與文獻報道基本一致［8］。提示ARK5和MMP－2參與了腫瘤的分化、增殖，尤其是侵襲和轉移。本研究還顯示，ARK5和MMP－2的表達呈正相關，這就說明兩者有密切相關。生存分析顯示，ARK5和MMP－2的高表達均預示SCLC患者預后不良，其中ARK5是SCLC患者獨立預后危險因素。

降解破壞細胞外基質和基底膜被認為是腫瘤轉移各個階段中的關鍵步驟之一。MMPs作為一種重要的蛋白水解酶家族，可以降解細胞外基質 (ECM)和基底膜成分以及一些非基質成分，從而改變腫瘤細胞的微環境，促進惡性腫瘤發生和發展，尤其是轉移和侵襲。

MMP－2是目前發現的與腫瘤侵襲關系最為密切的一種MMPs，可激活MMP－9［11］，兩者均是最重要的MMPs家族之一，臨床上有重要的作用。胃癌的轉移侵襲已被證實與MMP－2和MMP－9的過表達密切相關［12－13］，這就為胃癌早期轉移提供了簡單實用的檢測方法，有利于胃癌的臨床治療。ARK5基因的過表達可通過調控 MT1－MMP的增加引起MMP－2基因的激活并刺激其分泌，這點已被Suzuki等［14］發現，從而證明了MMP－2是ARK5的下游信號分子。

盡管ARK5及MMP－2都被證實在腫瘤的發生、轉移、侵襲中有一定的作用，但它們具體的作用機制及相互調控關系仍未完全闡明。Suzuki等［14］進一步猜測，由于癌組織血供不足和缺氧導致Akt的激活和AMP生成增加，進而激活ARK5，導致對營養饑餓的耐受和MT1－MMP產物的上調，激活了MMP－2，從而刺激了腫瘤的侵襲和轉移。

總之，SCLC癌組織中ARK5和MMP－2均過表達，與肺癌的浸潤、轉移、分化相關。因此，可以通過檢測ARK5和MMP－2的表達來判斷肺癌的轉移情況和預后，了解病情嚴重程度，尋求抑制ARK5高表達的方法，來抑制腫瘤浸潤轉移，為腫瘤的靶向治療提供新的靶點，增加臨床療效，改善肺癌的不良預后，同時為腫瘤發病機制的研究提供新方法。

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