ALDH1+、CD44+/CD24-重疊與乳腺癌基因亞型和臨床因素的相關性研究

曾妮，韓明利，屈洪波，朱志坤，蔡建英，陳力學，吳誠義

（重慶醫科大學附屬第一醫院1.內分泌外科；2.重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016）

ALDH1+或CD44+/CD24-表達是目前公認的檢測分析乳腺癌干細胞較為廣泛的標志物，在細胞成瘤實驗中，ALDH1+CD44+CD24-已被證實成瘤能力和轉移能力最強［1］，而鮮見人類乳腺組織同例標本中重疊表達此兩種干細胞標志物的情況研究。本實驗使用免疫組化單染和雙染技術聯合檢測我院203例乳癌患者標本中ALDH1和CD44/CD24表達情況，探討分析它們在基因亞型中的分布及與臨床各因素的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集重慶醫科大學附屬第一醫院2006年9月至2011年9月行乳腺癌改良根治術和B超引導下核心穿刺活檢術患者的手術標本，術前均未接受放化療、內分泌治療、靶向治療，術后石蠟病理報告均證實為乳腺癌，除外Ⅳ期乳腺癌、資料不完整或失訪患者，納入本次研究的乳癌患者共有203例，均為女性，其病理類型包括浸潤性導管癌140例，浸潤性小葉癌22例，髓樣癌9例，黏液腺癌14例，其他類型癌18例。術后根據臨床分期、ER、PR、Cerb-B2情況選擇或聯合放化療、內分泌治療、靶向治療等?；颊唠S訪3～28個月，中位隨訪時間為12個月，隨訪方式主要為電話訪問、門診復查和本院病案科歷史病歷查詢。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑：ALDH1兔抗人多克隆抗體購于英國Abcam公司；CD24兔抗人單克隆抗體購于中國北京博奧森生物技術有限公司；CD44鼠抗人單克隆抗體、Polymer雙染檢測試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒均購于中國北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 實驗方法：收集標本石蠟包埋，4 μm厚連續切片4張，1張行HE染色，另2張行免疫組化染色，1張備用。（1）免疫組化單染ALDH1：常規脫蠟水化，3%H2O237℃浸泡15 min，枸櫞酸鹽緩沖液微波熱修復30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min 3次，3%正常羊血清培育25 min，加一抗（ALDH1兔抗人抗體工作液濃度1∶100）4℃過夜，復溫1 h，PBS洗滌30 min，加入二抗37℃30 min，PBS洗滌30 min，顯微鏡下控制DAB顯色，清水終止顯色，蘇木素染色4 min，鹽酸酒精2 s，碳酸鋰1 min，二甲苯20 min，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。（2）免疫組化雙染檢測CD44+/CD24-的表達：CD44和CD24抗體的工作液濃度分別為1∶50和1∶100。實驗步驟按雙染試劑盒說明書進行，DAB和AP-Red顯色，蘇木素復染，用CD44和CD24單染免疫組化做對照。

1.2.3 結果判定：

1.2.3.1 免疫組化單染結果判定 ALDHl陽性細胞為細胞質和細胞膜棕黃色。根據顯色細胞比例為染色結果評分。按陽性染色細胞比例評分：0～10%為陰性0分；10%～25%為陽性1+；25%～50%為陽性2+；超過 50%為陽性 3+［2］。

1.2.3.2 免疫組化雙染結果判定 CD44陽性細胞為細胞膜棕黃色，CD24陽性細胞為細胞質紅色，呈棕黃色無紅色的細胞鑒定為CD44+/CD24-，結果判讀參照Honeth等［3］的評分方法：無陽性細胞為0分；陽性細胞1%～<10%為1分；陽性細胞10%～<5 0%為2分；陽性細胞50%～<75%為3分；陽性細胞75%～100%為4分。0分為陰性，≥1分為陽性。

1.2.3.3 HER-2結果判定 根據重慶醫科大學病理診斷中心報告，HER-2免疫組化染色不表達或“+”被判定為陰性，“++”或更高表達加用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 進行驗證，FISH擴增為陽性，相反則為陰性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17．0軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，生存分析采用Kaplan Meier法、log-rank檢驗比較生存差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌基因亞型中的分布

ALDH1表達位于細胞質和（或）細胞膜，呈棕黃色；CD44表達位于細胞膜，呈棕黃色；CD24表達位于細胞質，陽性表達呈紅色，棕黃色無紅色為不表達，見圖1。

2011年第12屆國際乳腺癌會議將ER、PR、HER-2、Ki67表達情況制訂5種新的乳腺癌基因亞型［4］，本實驗根據重慶醫科大學病理診斷中心報告，203例乳腺癌中：Luminal A型39例 （19%）；Luminal B （HER-2-）型90例（44%）；Luminal B（HER-2+）型 21例（10%）；HER-2型 22例（11%）；Triple negative型31例（15%）。ALDH1陽性表達為20例（10%），主要在HER-2型（20%）和Triple negative型（40%）高表達，ALDH1陽性在乳腺癌各分子亞型中的表達差異具有統計學意義（P=0.006）。CD44+/CD24-表型為 84例（41%），Triple negative型乳腺癌組織中含CD44+/CD24-表型為24例（77%），明顯高于其他分子亞型，差異具有統計學意義（P=0.000）。ALDH1+/CD44+/CD24-/low型為11例（5%），主要分布在HER-2型（18%）和Triple negative型（45%），差異有統計學意義（P=0.000），見表1。

表1 ALDH1、CD44/CD24及聯合ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌各分子亞型中表達的比較（例）Tab.1 The distribution of ALDH1+，CD44+/CD24-and the combination of ALDH1 and CD44/CD24 in breast cancer molecular subtypes（case）

2.2 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性

結果顯示，ALDH1+表達與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結狀態、病理類型、ER，PR等臨床相關變量分布差異無統計學意義（P>0.05），而與臨床分期有關（P<0.05）；CD44+/CD24-、ALDH1+/CD44+/CD24-表型與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結狀態、ER，PR等臨床相關因素無明顯相關性（P>0.05），而與病理類型有關（P<0.05），見表2。

2.3 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者2年無病生

存率關系及復發和轉移情況

ALDH1+患者2年無病生存率為55%，ALDH1-患者2年無病生存率為82%；CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為76%，非CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為83%；ALDH1+/CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率為36%，明顯低于其他類型，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

表2 ALDH1、CD44/CD24與乳腺癌患者臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between ALDH1，CD44/CD24 expressions and clinicopathological characteristics in patients with breast cancer

目前腫瘤干細胞的分選及標志物的準確選擇成為“腫瘤干細胞學說”的瓶頸，乳腺癌干細胞標志物的選擇主要集中在 ALDH1+、CD44+/CD24-之間［5］。CD44+/CD24-作為干細胞標志物具有組織特異性，即其只是乳腺癌干細胞標志物［6］。在本組實驗中，表達CD44+/CD24-表型乳腺癌有84例（41%），主要存在于Triple negative型，很多研究認為CD44+/CD24-表型與 basal-like 型乳腺癌密切相關［2，7］，Sheridan等［8］分析了13種乳腺癌細胞株，發現表達CD44+/CD24-表型的所有細胞系存在于基底的/間充質的/肌上皮的亞型細胞系中，表達CD44+/CD24-表型的乳癌細胞只表達基底/間葉/肌上皮細胞標志，缺乏管腔上皮細胞標志表達，他們認為表達CD44+/CD24-表型的乳腺癌細胞也許起源于基底的/肌上皮的細胞，并且CD44+/CD24-表型乳腺癌細胞高表達侵襲性基因，患者預后差。還有研究提示basal-like型乳腺癌可通過誘發EMT使非CD44+/CD24-表型乳腺癌細胞表達CD44+/CD24-表型［9］，這也許是basal-like型乳腺癌高表達CD44+/CD24-表型的原因之一。本實驗結果顯示CD44+/CD24-表型與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結狀態、ER，PR等臨床相關因素無明顯相關性，但與病理類型有關，主要存在于浸潤性導管癌，CD44+/CD24-表型患者2年無病生存率較非CD44+/CD24-表型差，這與以往報道結果基本一致［10］。

ALDH1是一種氧化還原酶，參與細胞內的醛氧化過程［5］，它作為腫瘤干細胞標志物沒有組織特異性。在本組實驗中，ALDH1+表達為20例（10%），符合干細胞只占腫瘤細胞極少比例的特性。主要在HER-2型（20%）和Triple negative型（40%）高表達，研究顯示［11］ALDH1+與 BRCA1 因子密切相關，ALDH1+/ER-型乳腺干/祖細胞可通過BRCA1的作用分化為ALDH1-/ER+上皮細胞，BRCA1一旦缺失，將導致ALDH1+/ER-型乳腺干/祖細胞的遺傳不穩定積累，最終導致管腔分化紊亂或管腔細胞凋亡進而發展成為乳腺癌。部分研究認為ALDH1+表達與HER-2過表達正相關，且ALDH1與HER-2是導致患者預后不良的危險因素［12］，也有研究結果提示ALDH1與HER-2不相關，HER-2過表達與組織學分級、淋巴結轉移無關［13］，這也許能提示腫瘤來源不同［14，15］或代表不同的遺傳變異［15］。ALDH1+與 CD44+/CD24-也許是通過不同層次來區別標志不同層次的乳腺癌干細胞［14］，這也可能暗示著不同的癌干細胞標志物指向不同的乳腺癌干細胞類型。ALDH1+與CD44+/CD24-單獨表達時，多數研究認為與患者臨床相關因素無明顯相關性，本組實驗將兩種標志物結合分析，得出重疊表達這兩種標志物的乳腺癌患者2年無病生存率明顯低于其他，這也許是結合兩種標志物純化了“癌干細胞群”，同時也可能代表了不同來源的癌干細胞，提示未來聯合癌干細胞標志物也許能預測患者預后。

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