pAcGFP1-C1-Ngb真核表達載體的構建及在SH-SY5Y細胞中的表達

楊前，高殿文

（1.大連醫科大學附屬第二醫院眼科，遼寧 大連11 6023；2.中國醫科大學附屬盛京醫院眼科，沈陽110004）

腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是2000年由德國Burmester等首先發現的一種攜氧球蛋白，是繼血紅蛋白（Hb）和肌紅蛋白（Mb）之后的第三種攜氧球蛋白［1］。主要在腦組織中表達，故命名。Ngb能夠可逆性地結合氧，與氧有很高的親和力，能夠特異性地向腦組織供氧，在神經系統氧的攝取、運輸和利用等生理過程中起極其重要的作用。即使血氧濃度較低，與氧具有很高親和力的Ngb仍將促進氧向線粒體的擴散或直接介導氧向線粒體的傳遞，促進ATP的產生，從而維持正常神經元的功能［2］。已有實驗證實，Ngb可以保護神經元免受缺血缺氧的損害［3，4］。視覺信息傳導過程中需要消耗大量的氧氣，因此視網膜是人體耗氧量最大的組織之一。視網膜中Ngb的含量是大腦中的100倍，分布于除色素上皮以外的所有視網膜神經細胞內［5］。Ngb與氧結合的特性，以及Ngb在視網膜的特異性分布為我們進行缺血缺氧視網膜疾病的研究帶來了全新的令人振奮的思路和方向。

本研究旨在構建以GFP為報告基因的重組表達質粒pAcGFP1-C1-Ngb，并將其轉入神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）中，為進一步研究Ngb基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

健康雄性成年SD大鼠1只，體質量210 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。質粒pAcGFP1-C1購自美國Clontech公司，大腸桿菌JM109為本室保存。RNAiso Plus、KpnⅠ限制性內切酶、BamHⅠ限制性內切酶、質粒抽提試劑盒、DL-2000 Marker，DNA膠回收試劑盒及RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0均購自大連寶生物工程公司。LipofectamineTM2000和DMEM培養液為Invitrogen公司產品，胎牛血清購于Gibico公司，SH-SY5Y細胞購自中國醫學科學院腫瘤研究所。引物的合成及DNA測序均由大連寶生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Ngb基因的PCR擴增：將SD大鼠斷頭處死，取出適量的腦組織，按照RNAiso Plus說明書提取總RNA，經分光光度計檢測其純度及含量。采用兩步法RT-PCR擴增Ngb基因。20 μL反轉錄體系包括：1 μL Total RNA，1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，4 μL5× PrimeScript RT Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），PrimeScript RTase0.5 μL，12 μL 去 RNase水。反應條件為：42 ℃，60 min；70℃，15 min。反應產物（大鼠cDNA）在-20℃保存。

根據大鼠Ngb基因的全長序列設計引物：Ngb上游引物：5′-ATAGGTACCATGGAGCGCCTAGAGT CAGA-3′，Ngb 下游引物：5′-AATGGATCCTTACTCC CCGTCCCAGCCTCG-3′以大鼠cDNA為模板，使用Prime STAR?HS DNA Polymerase試劑盒進行PCR擴增。50 μL反應體系包括：1 μL反轉錄反應液，10 μL5× Prime STAR Buffer（Mg2+plus），0.5 μLNgb 上游引物（20μmol/L），0.5μLNgb下游引物（20μmol/L），4 μL dNTP Mixture，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），33.5 μL dH2O。反應條件為：94℃3 min，98℃10 s→68℃1 min，共30個循環。將PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒切膠回收上述Ngb基因PCR擴增產物（456 bp）。經BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切后，回收備用。

1.2.2 重組真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb的構建及鑒定：將上述回收純化的Ngb基因PCR擴增產物與pMD19-T Vector連接，轉化大腸桿菌JM109，挑取陽性菌落提取重組質粒pMD19-Ngb。分別使用限制性內切酶KpnⅠ和BamHⅠ對pMD19-Ngb及pAcGFP1-C1商品化空載體進行雙酶切處理。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，切膠回收pAcGFP1-C1/KpnⅠ/BamHⅠ線性載體片段和pMD19-Ngb/KpnⅠ/BamHⅠ中的Ngb基因片段，將二者使用DNA連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌JM109，提取重組表達質粒pAcGFP1-C1-Ngb并進行核苷酸序列測定。

1.2.3 重組真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb轉染SH-SY5Y細胞及其表達：質粒DNA的制備：大量提取無內毒素質粒pAcGFP1-C1-Ngb，分光光度計測定并計算質粒濃度，保存備用。

神經母細胞瘤細胞培養：神經母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y）在37℃、5%CO2條件下置于10%胎牛血清的DMEM液中培養。2 d換液1次，2～3 d用消化液常規消化傳代。取對數生長期細胞進行各項實驗。在進行轉染的前1 d，將細胞間隔交叉接種在6孔培養板，細胞密度為2×105/孔，培養24 h達60%～80%融合。

pAcGFP1-C1-Ngb質粒的脂轉：將SH-SY5Y細胞分為2組，轉染組和空白對照組，轉染組按照Lipofectamine2000說明書進行質粒轉染，繼續培養48 h后，收集2組細胞檢測Ngb蛋白的表達。

蛋白表達的檢測：轉染后48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況。Western blot檢測2組細胞Ngb表達情況。

2 結果

2.1 Ngb目的基因的PCR擴增

Ngb目的基因PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統上觀察電泳結果，于500 bp附近可見一較亮條帶，未見有非特異條帶存在（見圖1）。

2.2 重組真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb酶切及測序鑒定結果

雙酶切產物中Ngb基因片段和線性載體pAcGFP1-C1經純化后的電泳鑒定結果（圖2、圖3）。

2.3 熒光顯微鏡觀察

倒置熒光顯微鏡下觀察，轉染48 h后，重組質粒pAcGFP1-C1-Ngb轉染組細胞發出綠色熒光（圖4），而空白對照組無綠色熒光發出。

2.4 Western blot結果

轉染組SH-SY5Y細胞中Ngb蛋白表達明顯高于對照組細胞（圖5）。

3 討論

Ngb是Burmester等在人和小鼠腦內發現的一類攜氧球蛋白，由151個氨基酸組成的單體蛋白，分子量為17 kDa。Ngb具有獨特的外顯子和內含子結構，Ngb基因缺乏TATA閱讀框。Ngb與血紅蛋白、肌紅蛋白同屬球蛋白家族，但氨基酸序列相似性很小（與血紅蛋白的同源性小于21%，與肌紅蛋白的同源性小于25%），這表明Ngb在進化上和功能上具有獨特性。Ngb主要在腦組織、視網膜及內分泌組織中表達［1］。Ngb能夠可逆地結合氧，且與氧有很高的親和力，能夠特異性地向神經組織供氧［2］。受此啟發，對缺血缺氧性視神經、視網膜疾病的治療提供了新思路。

為了進一步研究Ngb的結構和功能，我們從雄性SD大鼠腦組織中提取總RNA，根據引物設計采用RT-PCR逆轉錄獲取cDNA，經測序分析，獲得其編碼序列為456個堿基，與基因庫里的大鼠Ngb編碼區序列完全一致，沒有堿基發生突變。隨后我們將PCR擴增的目的片段連接到T載體（TS-Ngb），利用基因重組技術將TS-Ngb及目的載體pAcGFP1-C1進行雙酶切，進行連接，構建真核表達質粒pAcGFP1-C1-Ngb。

質粒pAcGFP1-C1是一種真核表達質粒，由GFP報告基因、SV40啟動子、多克隆酶切位點和卡那霉素及新霉素抗性基因等組成。報告基因GFP是最早從水母中分離出來，其基因編碼區序列長714 bp，蛋白相對分子量約26 kDa。用波長約450～490 nm的藍光線激發后發出綠色熒光，可通過熒光顯微鏡直接觀測。GFP無需任何的作用底物或共作用物。檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率。GFP蛋白本身性質穩定，可在多種異源生物中表達且無細胞毒性。GFP基因片段長度較小，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，為研究其他基因表達產物的分布提供了方便。GFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發光。

本實驗成功構建了GFP與Ngb基因直接嵌合生成的真核表達載體pAcGFP1-C1-Ngb，以表達產生融合蛋白，既保留了Ngb蛋白的神經保護活性，又能通過融合蛋白表達后仍能保持熒光激發活性。在后來的實驗中，我們將pAcGFP1-C1-Ngb轉染至SH-SY5Y細胞中，倒置熒光顯微鏡下可明顯觀察到細胞呈綠色熒光，說明融合蛋白成功表達。而對轉染的SH-SY5Y細胞Westernblot檢測也進一步說明Ngb基因已成功插入到真核表達載體pAcGFP1-C1中，真核表達載體構建成功。為后續的實驗研究打下了基礎。

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［3］Sun Y，Jin K，Mao XO，et al.Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（26）：15306-15311.

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