人肺腺癌腦轉移動物模型建立及顯像的研究

雷貝 曹杰 沈杰 趙蘭香 梁勝 孟慶剛 謝文暉 楊順芳

肺癌已連續多年是全世界癌癥死亡的主要原因[1]，近年來也已成為我國發病率和死亡率第一位的惡性腫瘤[2]。臨床上，腫瘤的轉移很少僅限于某個單臟器轉移，尤其肺癌的轉移：骨（35%-80%）、腎上腺（53.7%）、肝（22%）、腦（10%）[3-6]。雖說腦轉移所占比例不大，但是危害性極大，一旦患者出現腦轉移預后極差。肺癌腦轉移是肺癌患者終末期表現之一，生存期很短，未經治療中位生存期僅1-3個月[7]。從肺癌組織脫落的腫瘤細胞不受肺毛細血管床的阻滯，可以直接進入體循環，流向腦部，因為有血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）存在，能保護中樞神經系統免受癌細胞侵襲，即使部分癌細胞進入內皮細胞層，BBB也能積極參與阻止轉移性細胞在大腦中溢出和擴散[8]。但是仍無法完全阻止部分癌細胞向腦組織侵襲，導致肺癌腦轉移的發生。有20%-30%的肺癌患者在診斷時即已經發生了腦轉移，40%-50%的肺癌患者在整個病程中會出現腦轉移[9,10]。但其具體轉移機制仍然未知，研究方法也較少，使得臨床治療療效很差，迫切需要進一步的研究。肺癌腦轉移細胞及其實驗動物模型的建立是研究肺癌腦轉移的重要基礎，但由于腦部的功能及結構的特殊性、腦轉移檢測方法的有限性，使肺癌腦轉移模型的建立非常困難。CPAYang1是偶然發現產生骨轉移同時伴發腦轉移的人肺腺癌細胞株，一次接種約有22%的裸小鼠產生腦轉移。借鑒以往應用裸小鼠體內反復接種可以篩選到某一器官特異性轉移亞株的方法[11-15]，本研究應用慢病毒介導綠色熒光蛋白轉染CPA-Yang1（green fluorescence protein, GFP）細胞，經裸小鼠左心室接種，MRI顯像和腦組織解剖，檢出并取出腦轉移灶行細胞原代培養及病理檢測，體內外反復篩選獲得較高潛能產生腦轉移的細胞亞株CPA-Yang1-BR，一次接種可有1/2的裸小鼠產生腦轉移。本研究改善了以往研究方法特異性差、成功率低、操作復雜等缺點，構建了人肺腺癌腦轉移細胞及其動物模型，建立了檢出腦轉移灶的方法以及深入研究的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周-10周齡、體重18 g-20 g的雄性BALB/c裸小鼠，由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，在SPF環境下飼養［實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2008-0043］。

1.2 腫瘤細胞 本課題組自建可傳代中國人肺腺癌細胞株CPA-Yang1[11]（國家發明專利號：No.200810200983.8），取自首診伴發顳骨溶骨轉移人肺腺癌患者的心包積液培養而成。細胞培養用10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37oC、CO2體積分數為5%的培養箱（Heraeus BB-16 CO2Incubators, Germany）中培養。血清及培養液購自美國Gibco公司（GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA）。慢病毒介導綠色熒光蛋白（GFP）轉染CPA-Yang1細胞的實驗由上海吉凱基因化學技術有限公司完成（圖1）。

1.3 肺腺癌腦轉移模型的建立

1.3.1 左心室注射建模[12,13]取經體外培養的對數生長期CPA-Yang1 GFP細胞，每只裸小鼠左心室接種7×105-8×105/0.1 mL細胞懸液。左心室注射2周后隔天稱重，體重低于16 g時嚴密觀察有否出現嗜睡、行動遲緩等癥狀或異樣體征。

1.3.2 動物影像學檢測 左心室接種造模7周-8周，當觀察到裸小鼠全身嚴重衰竭、呼吸短促、體重減輕20%時，為裸小鼠腹腔注射硫噴妥鈉麻醉后行micro PET/CT顯像、X線、放射性核素、熒光（三合一）活體成像系統和小線圈MRI顯像。

1.3.2.1 Micro PET/CT scanners顯像（Inveon micro PET/CT,Siemens Preclinical Solution, Knoxville, TN, USA） 對荷CPA-Yang1細胞的裸鼠尾靜脈注射18F-FDG 0.2 mci/只，30 min后行micro CT和micro PET顯像。

1.3.2.2 三合一活體顯像系統［Kodak FX PRO in vivo Imaging System Multispectral (Kodak, USA)］ 顯像前2 h-3 h每只小鼠尾靜脈注射放射性核素99mTc-MDP 2mCi。圖像采集條件：excitation= 730 nm，emission= 790 nm；視野直徑為12 cm，熒光/X線/放射性核素曝光時間4/1/10 min；照相機設置為4×4像素單元；分別顯像后獲得熒光、X線和放射性核素融合圖像。

1.3.2.3 MRI with sense body采集（1.5 Tesla MRI unit, Philips Healthcare, The Netherlands） 小鼠MRI顯像無需注射造影劑，顯像序列為：T1WI、T2WI、FLAIR。記錄腦內異常信號灶的數量、部位、大小等信息。

1.3.3 病理檢測 顯像完成后深麻醉處死裸小鼠，在無菌條件下取出異常眼球、完整腦組織，若肉眼能觀察到眼、腦組織存在綠色腫塊（GFP），則提示有腦轉移病灶并拍照做記錄；腦組織和部分病灶組織以10%甲醛溶液固定，行常規石蠟包埋切片，H&E染色，光學顯微鏡下觀察轉移情況，另外部分病灶進行體外細胞培養。

1.3.4 體內外篩選肺腺癌腦轉移亞株 將腦轉移腫瘤組織，剪碎成1 mm-2 mm直徑的組織塊，放置于培養瓶中行原代細胞培養（培養條件同前），待細胞貼壁后增殖生長至約90%密度時按1:2比例傳代擴增。將此體外擴增腦轉移細胞再次經左心室注射接種裸小鼠，重復體內建模-體外培養增殖過程，經4個循環后篩選出具有較高潛能腦轉移的肺腺癌細胞亞株。

1.4 各輪次細胞與其源細胞CPA-Yang1的比較

1.4.1 細胞倍增時間 各輪次細胞取1×104個細胞/每孔，接種于24孔板中，培養24 h后取3孔細胞計數并計算均值，按公式TD=t*[lg2/(lgNt-lgNo)]得到細胞倍增時間[16]，在各時間段，倍增時間是不同的，設定取24 h-48 h時間段；也可使用專業計算軟件http://www.doubling-time.com。CPA-Yang1細胞倍增時間見參考文獻[11]。

1.4.2 轉移率計算 綜合以下兩方面判斷腫瘤轉移率：①經病理證實的每組裸鼠腦轉移率；②經病理證實的每組腦轉移裸鼠的轉移部位數量。

2 結果

2.1 荷瘤小鼠的表現 約在左心室造模6周-7周后可發現模型鼠或出現嗜睡，或1只/2只眼睛失明，或頭骨鼓出，這些都提示有腦轉移存在，需密切關注小鼠的生命體征，防止過度衰竭而亡（圖2）。

2.2 模型鼠分子影像檢測18F-FDG micro PET/CT顯像，采集的圖像由計算機處理后分別獲得CT、PET和兩者融合的圖像（圖3），能發現腦部濃聚18F-FDG，但不能肯定是骨轉移還是腦轉移。小動物“三合一”活體成像系統在檢出腰椎轉移的同時發現頸椎以上腦部也有綠色熒光顯示病灶，提示可能伴發腦轉移（圖4）。帶小動物線圈的MRI顯像檢測荷瘤小鼠的腦內異常信號病灶最為清晰（圖5）。

2.3 細胞生物學變化

2.3.1 細胞倍增時間 每輪次細胞倍增最快時間在24 h-48 h之間，1st、2nd、3rd、4th的倍增時間分別為：22.59 h、19.68 h、17.34 h和16.88 h。

2.3.2 體內外篩選腦轉移細胞的形態變化 各細胞形態見圖6；早期（p3）及傳代半年時間（p34）的CPA-Yang1是人肺腺癌細胞株，分別見圖6A（a）和（b）。細胞呈多核，半貼壁、半懸浮狀。經細胞體內外4次篩選，細胞呈懸浮、圓形狀變化。

2.4 病理 CPA-Yang1腦轉移小鼠病理見圖7，同時可見轉移灶的周圍血管密度隨輪次上升而增加。

2.5 肺腺癌細胞各輪次左心室接種后腦轉移發生率 腦轉移細胞通過眼管侵襲視神經使得眼球轉移-失明，發生率約為6%（2/33）。腦轉移發生率與輪次相關（表1）。根據病理和解剖，每只腦轉移小鼠僅發現腦轉移灶1個；腦轉移病灶大小1 mm2-8 mm2，有占據整個小腦的，也有位于大腦近嗅腦處的病灶。病灶分別分布在嗅腦2個，大腦4個，小腦3個，視神經2個。

圖 1 慢病毒介導轉染GFP后的CPA-Yang1細胞。A：倒置顯微鏡光鏡下的細胞；B：熒光倒置顯微鏡下的A圖細胞（×100）。Fig 1 CPA-Yang1 with lentiviral vector-mediated transfection of green fluorescence protein (GFP). A: light-field; B: green fuorescence (×100).

圖 2 荷CPA-Yang1 GFP細胞左心室造模5周-7周后腦轉移裸鼠。A：小鼠自造模第5周始嗜睡，活動日漸減少，進食也下降，白色箭頭指向該小鼠額頭明顯鼓出；B：是A鼠解剖取出的腦組織，綠色箭頭所指部分疑嗅腦轉移灶；C：小鼠自造模第6周始，眼睛失明，進食全靠觸須和嗅覺；D：第7周解剖模型鼠取腦組織，發現綠色（GFP）轉移灶（黃色箭頭）。Fig 2 The brain metastasis mice with CPA-Yang1 GFP cells by intracardiac inoculation after 5-7 weeks. A: Since fifth week, the mouse appeared lethargy, activity decreased, eating also fell, the white arrow indicated to the bulging forehead suspected brain metastasis; B: Autopsy of (A)mouse brain tissue, the green arrow indicated bigger lesion of olfactory bulb brain metastases; C: The mouse eyes blind gradually after the inoculation six weeks, eat all by tentacles and smell; D: Dissect out brain tissue in the mouse at seventh week; the yellow arrow indicated the small GFP lesion.

圖 3 荷CPA-Yang1裸鼠50天行18F-FDG micro PET/CT顯像（矢狀位），從左-右分別為CT、FDG和融合圖像。該裸鼠被檢出在下頜骨（桔黃色箭頭）、腰椎（紅色箭頭）骨轉移，同時伴有后腦部濃聚FDG（白色箭頭），但是骨/腦轉移無法辨別。Fig 3 18F-FDG micro PET/CT imagings detected the model mouse after inoculation 50 days (sagittal). CT, FDG and fusion image from left to right respectively. The mouse was found bone metastasis in mandibular (orange arrow) and lumbar (red arrow), but not sure bone/brain metastases as back of the head accumulated FDG (white arrow).

圖 4 三合一小動物活體成像系統疑該小鼠在胸椎轉移的同時伴有腦轉移可能。Fig 4 Small animal in vivo imaging system for fluorescence, radionuclide and X ray fused imaging suspected metastasis in thoracic vertebra associated with brain of the mouse.

圖 5 對CPA-Yang1細胞造模40天的裸鼠行帶小動物線圈的MRI顯像，結果清晰顯示小鼠小腦半球轉移（白色箭頭示）。Fig 5 MRI imaging of the mouse bearing CPA-Yang1 with small animals coil (sense body) resulted clear display cerebellar hemisphere lesion(white arrow).

表 1 腦轉移發生率Tab 1 The morbidity of brain metastasis

圖 6 CPA-Yang1細胞的相差倒置顯微鏡拍攝圖片。A：人肺腺癌細胞株（×100），（a）早期細胞形態（p3），多懸浮；（b）傳代至（p34），多核； B：模型鼠首代腦轉移細胞爬出的狀況（×200）懸浮，成團細胞較多；C：第2輪次腦轉移細胞，梭形細胞減少，圓形（懸浮）、多邊形細胞占多數（×100）；D：第3輪次細胞圓形占多數（懸浮），更活躍（×100）；E：第4輪次懸浮細胞還是占據多數，同時梭形、多邊形也有一定比例（×200）。隨著輪次的變化，細胞呈小型圓形和懸浮狀變化。Fig 6 Morphology of the CPA-Yang1 cells under the contrast phase inverted microscope. A: Human lung adenocarcinoma cell line (×100), (a)third passage cells more suspension, (b) 34th passage cells suspension and more nucleus; B: First brain metastasis clone presented appearance of growth (×200); C: The brain metastasis clone of 2nd cycle, suspension, polygon cells in the majority; D: The clone of 3rd cycle, suspension cells in the majority (×200); E: Suspended cells of 4th cycle in the majority too (×200).

圖 7 小鼠病理 (HE, ×100)。A：正常腦組織；B、C、D：分別是第1、2、3輪次腦轉移灶，病灶血供隨輪次增加而增加；E：是第4輪次腦-眼轉移灶，左下角粉紅色為眼晶體；F：第4輪次腦轉移灶，細胞呈圓形分布。Fig 7 Histological features (HE, ×100). A: The brain of disease-free nude mouse; B, C, D is the lesions of brain metastases in 1st, 2nd, 3rd cycle respectively and diffusive blood supply increases with the cycles; E: The brain metastasis to eye, the lower left corner that pink color is an eye crystal; F: The brain metastasis lesion of 4th cycle, the cells presented circular distribution.

3 討論

研究肺癌腦轉移需要建立可靠的細胞及動物模型，是探討肺癌腦轉移機制和阻斷研究的前提。國內外有關腫瘤腦轉移模型研究的報道很多，而對中國人肺腺癌患者轉移發生率同樣較高的腦轉移細胞和動物模型的研究卻少見報道。

不同的惡性腫瘤細胞具有不同的生物學特性，只有部分惡性腫瘤能產生腦轉移，腫瘤轉移模型的建立依賴于高致瘤能力的腫瘤細胞，目前研究結果提示能夠引起腫瘤發生、轉移的細胞只占腫瘤細胞中的少量，而大部分的腫瘤細胞并不具備轉移侵襲能力。即使對于同一惡性腫瘤而言，雖然大多是單克隆細胞起源，為同基因型，但其增殖、侵襲和轉移特性并不完全相同。腫瘤細胞在轉化、生長過程中的自然篩選及其與機體免疫系統的相互作用，使不同腫瘤細胞亞群獲得了不同的生物學特性，從而使腫瘤細胞具備了生物學活性的異基因型[17]。在可以產生腦轉移的惡性腫瘤中，不是所有的腫瘤細胞都具有產生腦轉移的能力，只有特定的對腦組織具有特異性親和力的亞群才具有這種能力[18]。血腦屏障能保護患者避免腫瘤細胞輕易擴散至腦組織，反之，能轉移到腦的腫瘤細胞必定具有非凡的侵襲潛能。1889年Paget提出的“種子與土壤”假設[19]，現代“種子與土壤”學說包括以下內容：①腫瘤是生物學的異基因型，包含不同血管化、侵襲及轉移活性的亞群；②轉移的整個過程就是特異性轉移的腫瘤細胞的篩選過程；③轉移的產生依賴于器官微環境與腫瘤細胞多方面的相互作用[20-22]。因此，腫瘤細胞株經反復多代接種免疫缺陷型動物并行篩選后，此類亞群細胞得到有效的富集，靶組織轉移率漸進升高。一些研究[23,24]報道通過手術肺葉原位嫁接，然后產生腦轉移及骨、腎上腺的轉移，這個方法無特異性且非常復雜，限制了其在腦轉移機制研究中的應用。頸動脈注射腫瘤細胞造模方法[25]，由于一次性強制進入腦組織的腫瘤細胞太多導致模型鼠生存期較短，不利于藥物療效觀察和向臨床醫學轉換研究，且不符合腦轉移生物學特性。左心室注射法很好地模擬了肺癌的血道轉移，即通過肺毛細血管床的腫瘤細胞及從形成的微轉移灶脫離的腫瘤細胞進入左心室，隨血流流向腦部，才能產生腦轉移。左心室注射可以減少肺毛細血管床滯留并生長的腫瘤細胞數，增加穿過腦實質的腫瘤細胞數，并延遲因肺癌而致的死亡，延長腫瘤細胞在腦內增殖生長的時間，從而獲得更高的腦轉移形成的成功率[26-28]；我們所選用的造模細胞是自主篩選培養的人肺腺癌細胞CPA-Yang1。以往的裸鼠實驗證實其首代致瘤，且尾靜脈、左心室種植后均產生溶骨性轉移，除了肺部約有10%結節外均未發現其它臟器轉移。我們已通過這種方法構建了特異性骨轉移的細胞及其動物模型[11,29]，同樣很多學者也支持上述理論[15,30]。

因小動物腦轉移的檢測技術存在局限性，很難通過活體早期影像檢測到腦轉移灶。這是將CPA-Yang1轉染GFP的原因，一則可以借助熒光活體成像系統；二則在解剖取材時可以借以辨別是否轉移、轉移灶在何處。既往實驗中的18F-FDG micro PET/CT顯像、X線、放射性核素、熒光（三合一）活體成像系統顯像均未明確檢測出小鼠腦轉移灶。分析原因可能是我們使用的放射性核素示蹤劑不是難以通過BBB，就是使腦內的本底較高，如18F-FDG，造成腦病灶檢出靈敏度降低；其次受到設備分辨率的限制，對于小病灶的檢出有一定難度；期待將來能開發出靈敏度、特異性更高的示蹤劑。熒光顯像受細胞內GFP的表達水平及組織衰減影響較大，且我們使用的三合一活體成像系統為平面顯像，沒有斷層或三維重建，對于深部組織的病變難以定位，無法鑒別腦轉移和顱骨轉移。實驗中偶然發現小動物線圈MRI掃描能清晰發現腦轉移灶并解剖根據（GFP）捕捉病灶。于是，在以后的檢測裸鼠腦轉移時，行MRI（with sense body）掃描+解剖查看綠色病灶（GFP），明顯提高了腦轉移灶的檢出率，尤其是深部、較小腦組織轉移灶。但是由于分辨率等的設備技術問題，早期微小轉移灶的檢出還存在一定的難度，寄希望于更靈敏的micro MRI。

CPA-Yang1-BR人肺腺癌腦轉移細胞株及其動物模型的成功建立為進一步篩選靶向腦轉移細胞奠定了基礎，也為系統研究肺癌的復發、轉移和治療提供了一個良好的實驗平臺，并將在今后的肺癌分子生物學的研究中發揮更大的作用。同時，小動物線圈MRI或micro MRI活體顯像是檢測小鼠肺癌腦轉移敏感、準確、無創的顯像方法。