檢測肺癌患者血清Cathepsin X及Cystatin C的臨床意義

張學德 侯彥麗 牛澤群 李維 孟夏 張娜 楊拴盈

組織蛋白酶（Cathepsins, Cats）屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶，最初發現涉及到溶酶體內蛋白轉換，近年來研究[1,2]表明，還參與腫瘤的發生、發展、轉移，有希望成為新的腫瘤診斷和預后判斷標記物。Cat B、Cat L等在肺癌、乳腺癌、頭頸癌及結腸癌等腫瘤中表達明顯增高，且高表達的患者預后更差，對預測腫瘤的復發和預后有潛在價值[3]。Cat X是最近發現的一種Cats家族成員，它的結構和功能特點明顯不同于其它Cats，有一個區別于其它Cats的非常短的原區（pro-region）和一個獨特的迷你環（mini-loop），Cat X不像其它Cats作為肽鏈內切酶發揮生物學作用，而靠水解羧基端氨基酸起作用。Cat X表達主要局限于各類免疫細胞中，如單核、巨噬細胞及樹突狀細胞[4]。它涉及到細胞間信號傳導、細胞粘附、增生以及遷移等作用[5-7]。研究表明Cat X表達上調與幽門螺旋桿菌感染[8]、多發創傷[9]、肺結核[10]有關，也有報道發現Cat X在前列腺癌[11]、胃癌[8]、惡性黑色素瘤[12]中表達明顯增高。此外，已經在多種腫瘤中發現染色體20q13中編碼Cat X基因明顯擴增[13,14]。

Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白質中的一種，在所有的有核細胞內以恒定速度持續轉錄與表達，無組織特異性，并存在于各種體液之中，不受年齡、性別、體重、炎癥等因素影響，是一種反映腎小球濾過情況的重要指標。目前研究[15]表明，它作為Cats抑制劑與Cats互相作用參與腫瘤發生、發展。近期研究發現血液、體液中cystatin C高表達的患者預后差，有希望作為預測腫瘤預后標記物。

目前為止，我們尚未發現肺癌患者血清Cat X的研究，cystatin C在肺癌患者血清研究的報道也少見，cystatin C作為Cats強有力的抑制劑，它與Cat X血清表達水平之間可能存在相關性。目前已有cystatin C與Cat B、Cat L的相關性研究，但是尚無cystatin C與Cat X之間的研究。本研究旨在檢測肺癌患者和健康人血清Cat X與cystatin C表達水平以及二者相關性和與肺癌臨床病理、預后關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2007年3月-9月西安交大二附院84例肺癌患者，其中男性50例，女性34例，年齡41歲-78歲，中位年齡61.5歲；鱗癌30例，腺癌40例，小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）14例。臨床分期（TNM分期），I期+II期28例，III期+IV期56例。所有患者均經過組織學或病理學檢查確診為肺癌，采血前均未行手術、放化療以及中成藥等其它抗腫瘤治療。另外，選取健康查體者36例作為對照組，男性20例，女性16例；年齡40歲-79歲，中位年齡60.4歲。本研究得到西安交大二附院倫理委員會許可，患者均簽署知情同意書。

1.2 標本采集 所有肺癌患者和健康體檢者分別抽取晨間空腹靜脈血3 mL，抽取后1 h內，4oC，3,000 g離心10 min，分離的血清-80oC凍存待檢。

1.3 檢測方法 Cat X及cystatin C水平均采用酶聯免疫吸附法測定。嚴格按照ELISA檢測試劑盒（上海郎卡公司）的說明書操作，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；然后樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；后分別加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，封板膜封孔，37oC恒溫箱溫育60 min。手工洗板法清洗，每孔加入底物A、B各50 μL，37oC避光孵育15 min，后每孔加入終止液50 μL，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。實驗重復3次。

1.4 隨訪 84例患者術后均進行了隨訪，總生存期OS定義為首次確診至患者死亡時間或末次隨訪時間。死于非肺癌相關原因的患者排除在本研究外。隨訪最長時間為60個月。

1.5 統計學處理 數據采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。每組數據均采用Mean±SD表示。組間差異采取Mann-Whitney和Kruskal-Wallis檢驗。Pearson's相關系數評價Cat X和cystatin C之間的相關性。Kaplan-Meier法（組間生存率比較采用Log-rank檢驗）及Cox單因素以及多因素風險回歸模型進行生存分析。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者和健康人Cat X和cystatin C表達水平比較肺癌患者及健康人血清Cat X水平分別為（2.24±0.07）ng/mL、（1.85±0.09）ng/mL；cystatin C分別為（529.77±6.15）ng/mL、（476.76±13.95）ng/mL。肺癌患者血清Cat X和cystatin C水平明顯高于健康人（P＜0.01）。此外，肺癌患者cystatin C/Cat X比值與健康人相比，差異無統計學意義（P=0.372）。Pearson相關分析顯示，肺癌患者血清Cat X與cystatin C水平無明顯相關性（r=-0.049,P=0.66）。

2.2 肺癌患者Cat X和cystatin C表達水平與臨床病理特征的關系 Cat X和cystatin C/Cat X與肺癌患者性別、年齡、病理類型、淋巴結轉移、細胞分化及TNM分期無明顯相關，但Cat X與病理類型有相關趨勢（P=0.076），cystatin C/Cat X與淋巴結轉移有相關趨勢（P=0.058）。cystatin C水平與肺癌分期相關，III期+IV期肺癌患者cystatin C水平明顯高于I期+II期（P=0.01），與其它臨床病理特征無關（表1）。

2.3 肺癌患者Cat X和cystatin C水平與預后的關系

2.3.1 Kaplan-Meier生存分析 將患者性別、淋巴結狀態、分化程度、分期分組，以及根據年齡、Cat X、cystatinC、cystatin C/Cat X的中位數以二分法的方式分＜中位數組以及≥中位數組，進行Kaplan-Meier生存分析，生存差異的統計學意義用Log-rank法判定。結果示低Cat X和高Cat X患者中位OS分別為22.9個月和15.8個月，差異有統計學意義（P=0.019, RR=1.678），低Cat X患者和高Cat X患者相比OS更長（圖1）。I期+II期和III期+IV期肺癌患者中位OS分別為23.8個月和15.4個月，差異有統計學意義（P=0.011, RR=1.827），晚期肺癌患者預后更差（圖2）。高、低cystatin C/Cat X值患者中位OS分別為23.5個月和18.5個月，差異無統計學意義，但有一定的差異趨勢（P=0.069）。性別、年齡、淋巴結狀態、分化程度以及cystatin C對肺癌患者OS無明顯影響（表2）。

表 1 肺癌患者血清Cat X和cystatin C表達水平與臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship of Cat X and cystatin C in the sera of patients with lung cancer on the clinicopathological parameters

圖 1 血清Cat X高表達組和低表達組肺癌患者Kaplan-Meier生存曲線Fig 1 Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with low or high levels of Cat X in sera

圖 2 TNM I+II組和III+IV組肺癌患者生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with TNM stage I+II or stage III+IV

2.3.2 Cox比例風險回歸模型分析 采取單因素及多因素Cox回歸法分析影響肺癌患者預后的獨立危險因素。利用Cox單因素回歸分析發現Cat X高表達以及TNM分期是影響肺癌預后獨立因素，繼續將各個變量引入Cox多因素回歸模型，結果顯示，僅有TNM分期是患者預后的獨立危險因素（表2）。

表 2 單因素和多因素分析肺癌Cat X、cystatin C及其它因素與預后的情況Tab 2 Univariate and multivariate analysis of Cat X, cystatin C, and other potential factors for prognosis in patients with lung cancer

3 討論

肺癌是目前發病率高的惡性腫瘤之一，大部分發現時已經是中晚期，失去了手術機會，患者生存期短，5年生存率約15%[16]。因此肺癌的早診斷、早治療至關重要。血清腫瘤標記物具有取材方便、方法易行等獨特優勢，在肺癌早期診斷、預后判斷中有重要價值，因此人們一直在尋找有價值的血清腫瘤標記物。

Cat X是近年來發現一種新的Cats，通常以酶原形式存在于免疫細胞的溶酶體內，受到激活后，轉化為有活性的酶釋放到血液和細胞外基質中[17]。Cat X在惡性腫瘤患者血清和細胞外基質中也有表達，Vizin等[18]研究了Cat X在結腸癌、腺瘤、其它結腸良性病變以及健康者血清中的表達情況，雖未發現Cat X在4組中表達有差異，但Cat X水平高的結腸癌患者OS更短。Decock等[19]比較了早期乳癌和炎性乳癌中血清Cat X水平，發現炎性乳癌患者中血清Cat X中水平低，有可能為炎性乳癌的診斷提供一定的參考價值。本研究檢測了肺癌患者和健康人血清Cat X水平，結果提示肺癌患者Cat X水平明顯高于健康人，提示Cat X可能與肺癌發生有關，有希望作為肺癌的腫瘤標記物。

Cystatin C是Cats抑制劑，可能會減輕Cats在腫瘤侵襲、轉移過程中作用[20]。Nishikawa等[21]用ELISA法檢測良、惡性卵巢瘤患者和健康人的血清cystatin C，發現卵巢癌患者血清cystatin C水平明顯高于良性腫瘤及健康人。Saleh等[22]也發現在結直腸癌組織中cystatin C高表達，特別是在腺癌中達到100%。然而也有研究[23]表明在肺鱗癌和正常肺組織中表達無明顯差異。Wegiel等[24]則發現前列腺癌中cystatin C表達減低。我們檢測了肺癌患者和健康人血清cystatin C水平，結果示肺癌患者血清cystatin C水平明顯高于健康人。究其原因可能是肺癌患者中Cats升高，cystatin C為了抑制其活性也隨之升高，但是仍然無法有效抑制蛋白水解酶的活性，導致腫瘤發生。

Cystatin C與Cats之間的失衡可能與腫瘤發生有關。Zore等[25]發現結腸癌患者血清Cat B的含量增加，cystatin C也隨之增加，但Cat B的活性并未被相應增加的cystatin C抑制，提示隨著腫瘤的進展，兩者改變的同時伴隨Cat B和cystatin C之間的失平衡。故有人把cystatin C與Cats的比值作為診斷腫瘤惡性程度的指標。本研究提示肺癌患者cystatin C/Cat X比值與健康人相比，無統計學差異，未見到cystatin C和Cat X失衡與肺癌相關。我們研究發現肺癌患者血清cystatin C和Cat X之間無相關性。Chen等[26]報道cystatin C與Cat B、Cat L之間無明顯相關。原因可能是由于cystatin C并不是Cats唯一的抑制劑，其它抑制劑如stefin A也可能涉及到Cats的抑制。

本研究顯示，Cat X與肺癌患者性別、年齡、病理類型、淋巴結轉移、細胞分化及TNM分期之間無明顯相關。Sevenich等[27]研究提示，在基因敲除的乳腺癌小鼠模型中，Cat X在腫瘤發展的初期表達增高，而在進展期及轉移瘤中表達降低。此外Hidaka等[13]研究結果提示20q13.2擴增與結腸癌進展和轉移有關。Wang等[28]研究也發現Cat X與晚期肝癌有關。而Lines等[29]報道了相反的結論，提示Cat X降低了細胞粘附，并減少胰腺癌轉移。這些不同研究結果可能由于樣本量偏小、檢測方法以及檢測標本不同或Cat X在不同腫瘤中表達不同所致。

本研究顯示，cystatin C與肺癌分期有關，但是與其它臨床特征之間無明顯相關。Vigneswaran等[30]研究發現cystatin C與乳腺癌淋巴結轉移無關，但與腫瘤大小有關。Saleh等[22]研究發現cystatin C在晚期結腸癌中表達高于早期結腸癌。本研究與上述研究一致，提示cystatin C升高可能與腫瘤浸潤、轉移有關。

本研究未發現cystatin C/Cat X比值與肺癌臨床病理特征相關。Kolwijck等[31]報道cystatin C/Cat H和cystatin C/Cat X比值與卵巢癌病理類型相關，在低分化癌中明顯升高。cystatin C與Cat X失衡與腫瘤研究甚少，還需要進一步擴大樣本量或在其它腫瘤上進一步研究。

本研究表明，Cat X低水平肺癌患者同高水平患者相比有更好的OS。Vizin等[18]報道了血清Cat X高水平的結腸癌患者OS更短，與結腸癌預后有關。本研究與Vizin等[18]研究一致，提示Cat X有希望作為判斷肺癌預后的指標。

我們研究提示，血清cystatin C高水平的肺癌患者OS短于低水平者（22.6個月 vs 13.7個月），但差異無統計學意義（P=0.105）。Strojan等[32]研究報道cystatin C與頭頸部腫瘤預后有關，cystatin C低表達的患者無病生存期更長。Kos等[33]研究了黑色素瘤患者中cystatin C與預后關系，未發現兩者之間存在相關性。

我們用單因素Cox回歸分析發現Cat X水平以及TNM分期是影響肺癌預后獨立因素，Cat X高水平以及晚期肺癌患者預后更差。多因素回歸分析表明分期是影響肺癌患者生存的獨立危險因素，晚期患者預后更差、OS更短，死亡的風險是早期的2.250倍。我們的結果進一步佐證了晚期肺癌預后更差。

總之，我們的研究初步證明在肺癌患者中血清Cat X和cystatin C水平升高，可能與肺癌的發生、發展有關。cystatin C在晚期肺癌中表達增高，可能與肺癌轉移、侵襲相關。Cat X高水平的患者OS更短，單因素Cox回歸分析顯示Cat X是影響肺癌患者預后的獨立因素。但本研究樣本量還不大，需要擴大樣本量進一步研究Cat X等因子與肺癌臨床特征及預后的關系。