納米二氧化硅在人支氣管上皮細胞內的亞細胞分布和遺傳毒性

趙光強 黃云超 李光劍 李森 周永春 雷玉潔 陳小波 楊凱云 陳穎 楊堃

隨著納米二氧化硅材料的出現和在生物醫藥工程、材料、化妝品等領域的廣泛應用，肺部是吸入暴露納米二氧化硅的主要靶器官，納米二氧化硅對肺部的生物毒性作用引起人們的廣泛關注。二氧化硅的致癌性國際上經歷了數十年的爭論。 國際癌癥研究組織（International Agency for Research on Cancer, IARC）于1987 年宣布石英為動物致癌物、人類可疑致癌物，1996 年10 月又宣布將石英由動物致癌物升級為人類致癌物，2010年再次得到確認[1]。盡管IARC已將石英定為人類致癌物，但由于流行病資料結果的不一致以及其作用機制尚未闡明，國內外學者對此仍存有爭議。

天然存在的游離二氧化硅粉塵的粒徑大小不一。眾多研究[2-4]表明，石英可以引起矽肺，但石英、矽肺和肺癌三者關系研究并不清楚，分析原因，可能是未考慮石英的粒徑因素。納米二氧化硅作為納米顆粒，由于粒徑小、比表面積大和不飽和鍵的存在，可能影響其在細胞內的亞細胞分布和自由基生成，造成比微米二氧化硅更大的遺傳毒性。

本實驗擬利用永生化人支氣管生皮細胞（immortalized human bronchial epithelium cells, BEAS-2B）研究不同粒徑納米二氧化硅和微米二氧化硅的細胞內亞細胞分布和DNA損傷情況，來評價二氧化硅粒徑對細胞遺傳毒性的影響，為納米二氧化硅的進一步遺傳毒性研究提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 納米二氧化硅和微米二氧化硅 納米二氧化硅：粒徑60 nm±5 nm，30 nm±5 nm，15 nm±5 nm。純度均＞99.65% （上海晶純實業有限公司）；微米二氧化硅：粒徑大小1 μm，純度＞99.5%（上海晶純實業有限公司）。

1.1.2 細胞株及主要試劑 永生化人支氣管上皮細胞株BEAS-2B（購自中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫）。該細胞系主要用于篩選誘導或影響分化及致癌的化學或生物制劑。LHC-8培養基、DMEM高糖培養基（Invitrogen/USA）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；胰蛋白酶（Pittsburgh, PA, USA）；25%戊二醛（Merck/UK）；四氧化鋨（EHSY/Hong Kong）；醋酸鈾（北京恒業中遠化工有限公司）；丙酮（深圳市華昌化工有限公司）；硝酸鉛（太原市欣吉達化工有限公司）。

1.1.3 實驗室配置試劑 磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline, PBS）( 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4, pH7.2）；0.1 M磷酸緩沖液的1%四氧化鋨固定液（0.2 M磷酸緩沖液10 mL；2%四氧化鋨10 mL）；檸檬酸鉛液1.33 g；檸檬酸三鈉1.76 g；去CO2重蒸水30 mL；劇烈振蕩30 min，呈白色懸液時，加入8 mL的1%NaOH，懸液澄清后加重蒸水至50 mL，pH12.0，環氧樹脂Epon618。

1.1.4 主要儀器設備 超凈工作臺（中國海爾集團）；BBD6220型CO2培養箱、MEGFUGE 10.0型低溫超速離心機（Heraeus/Germany）；8600型-80oC超低溫冰箱、Biorad Model 450型酶標儀（Thermo/Germany）；-20oC低溫冰箱（中國中科美菱集團）；1730MK型蒸氣高壓滅菌器（Tuttnauer/Israel）；CPA225D型電子分析天平（Sartorius/Germany）；U-LH100HG型倒置相差顯微鏡（OLYMPUS Optical/Japan）；DM4000B顯微攝影系統、R型0.1 μm超薄切片機、DFC320數碼相機及IM50攝影軟件（Laica/Germany）；JEM-100CX II型透射電子顯微鏡（日本電子公司）； XL30ESEM-TMP掃描電子顯微鏡（PHILPS/Holland）；Phoenix+DIM一體化能譜及電子背散射衍射儀（EDAX/USA ）；TE-200U型熒光顯微鏡（NIKON/Japan）；流式細胞儀（Becton Dickinson FACScan/USA）；高通量彗星試驗平臺、彗星圖象智能分析軟件Comet A 1.0（bio-radCo/USA）；超聲波分散儀（FS-60H, 130 W, 20 kHz, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,USA）。

1.2 方法

1.2.1 BEAS-2B的培養 將BEAS-2B培養于LHC-8培養基中，培養條件為 37oC、5%CO2的培養箱。每3天傳代1次，傳代后第3天換培養液。

1.2.2 不同粒徑二氧化硅DMEM培養基的配制 用分析天平分別稱取微米二氧化硅（粒徑1 μm）、納米二氧化硅（粒徑：60 nm、30 nm、15 nm），置于MK半自動型蒸氣壓力滅菌器中消毒30 min。在超凈臺里將消毒后的不同粒徑二氧化硅分別用DMEM培養基配置成濃度為25 mg/mL、50 mg/mL和75 mg/mL，充分攪拌混勻，4oC儲存備用。

1.2.3 二氧化硅顆粒物懸浮溶液配制及處理BEAS-2B細胞BEAS-2B細胞在含10%胎牛血清的Ham's F-12（含L-谷氨酰胺Cellgro USA）培養基中培養，培養基中加入100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，在37oC、5%CO2培養基中孵化。取對數生長期的BEAS-2B細胞接種于96孔培養板中，5×104個細胞/孔。每組設3個復孔，待細胞貼壁48 h后分別加入不同濃度、不同粒徑的二氧化硅懸浮液共同培養。使細胞培養基中的刺激濃度分別達25 mg/mL、50 mg/mL和75 mg/mL。處理24 h后，檢測細胞成活率變化情況。

1.2.4 細胞成活率的測定 應用臺盼藍抗法檢測細胞成活率，將細胞收集在用HBSS溶液配制的0.25%胎盼藍溶液中，使最終溶液達1.5 mL并置于冰上，死亡或損傷的細胞被染成藍色，有活性細胞不被染色，5 min后應用細胞計數器計算每個培養基中無活性細胞占總的細胞的百分比。從而得到活性細胞的比率。每組設3個復孔，每個試驗設3個重復。

1.2.5 透射電鏡檢測處理后BEAS-2B細胞內不同粒徑二氧化硅的分布 透射電子顯微鏡觀察不同粒徑二氧化硅（濃度為50 mg/L）處理24 h后，二氧化硅顆粒物在BEAS-2B細胞內賦存分布和細胞超微結構改變。

1.2.5.1 細胞樣品制備 取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，調整細胞密度至1×105個/mL接種于培養皿（直徑35 mm）中，在37oC、5% CO2培養箱內培養24 h，棄上清，分別加入不同濃度不同粒徑二氧化硅DMEM培養基的配制溶液20 mL。分別在37oC、5% CO2培養箱內培養24 h后，棄去上清液，PBS洗2次，移入Ep管中，1,500 rpm、10 min，至管底有細胞塊狀聚沉物，離心后棄上清。3%戊二醛（1/15 mol/L, pH7.4）和1%四氧化鋨（0.24 mol/L PBS, pH7.4） 各1 mL，固定1 h；系列乙醇脫水，Epon812樹脂包埋。

1.2.5.2 連續超薄切片術及電鏡觀察 取一個舊樣品塊作為樣品托，將樣品托的凸出部分用銼刀銼成一個平面， 再將Epon812樹脂涂在該面上，將上述修好的包埋塊粘到樣品托上，放入60oC烤箱中聚合24 h。用鉆石刀在Reichet S型超薄切片機上切連續超薄切片，每張切片厚度為75 nm-80 nm。切片用醋酸雙氧鈾染色20 min，檸檬酸鉛染色7 min。透射電鏡觀察。

1.2.6 單細胞凝膠電泳實驗（彗星實驗）檢測BEAS-2B細胞處理后DNA損傷情況 用不同粒徑的納米二氧化硅和微米二氧化硅處理BEAS-2B細胞24 h后，棄上清，每孔細胞用0.1 mL PBS漂洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，收集2復孔細胞于0.2 mL的PBS中，制成單細胞懸液。取500 μL的0.6%正常熔點瓊脂糖鋪于單面全磨砂的載玻片上，作為第一層膠，于4oC固化5 min；37oC下將單細胞懸液與0.75%的低熔點瓊脂糖1:1混勻，取100 μL混合液鋪于第一層膠上，蓋上蓋玻片，于4oC固化，5 min后揭去蓋玻片；取100 μL 0.75%低熔點瓊脂糖鋪于第二層膠上，于4oC固化5 min；5 min后將膠板浸于4oC裂解液里裂解1 h；取出膠板，浸于4oC電泳液里解螺旋20 min；電泳儀電泳：0.86 V/cm（25 V, 300 mA）4oC、20 min。電泳結束后，膠板用Tris-HCl（pH6.8）中和，每張膠板用100 μL的EB染色，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。啟動Comet A 1.0彗星圖象智能分析系統進行圖像的捕捉與數據的分析，用40倍的物鏡進行計數。每個濃度制備兩張膠板，每個膠板計數50個細胞（即100個細胞/濃度劑量），計算拖尾率，測量尾長。以Olive尾矩（olive tail moment, OTM）表示DNA損傷程度。

OTM=慧尾DNA含量×尾長

彗星圖像判斷標準：顏色較亮呈球形的為彗星頭部，代表未斷裂的、分子量較大的DNA片段；顏色偏暗呈彌散狀的為彗尾，代表斷裂的、分子量較小的DNA片段。用彗星尾長和彗尾DNA含量的乘積尾矩作為評價指標。

1.3 統計學處理 實驗數據均采用SPSS 18.0統計軟件包進行統計分析。數據進行分析時每組數據先進行正態性檢驗，如資料服從正態分布或經轉換后服從正態分布，則實驗數據以Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞成活率檢測結果 經25 mg/mL、50 mg/mL和75 mg/mL的15 nm、30 nm、60 nm和1 μm二氧化硅顆粒物刺激支氣管上皮細胞24 h后，發現支氣管上皮細胞的成活率隨刺激濃度的增加而下降，當刺激濃度為50 mg/mL時，納米二氧化硅顆粒物組的支氣管上皮細胞成活率開始明顯下降，分別下降到76.6%、64.1%和87.6%，而1 μm二氧化硅顆粒物組的細胞成活率下降不明顯，為90.2%（圖1）。

我們根據細胞成活率的研究結果，進一步研究50 mg/mL的二氧化硅顆粒物刺激支氣管上皮細胞24 h時，二氧化硅顆粒物在亞細胞內的分布和對DNA的損傷情況。

2.2 透射電子顯微鏡觀察不同粒徑二氧化硅細胞內分布50 mg/mL的二氧化硅顆粒物刺激24 h后，透射電鏡觀察DMEM組（陰性對照） 細胞內外均未發現納米粒子。細胞表面伸出偽足，形成絨毛狀結構。細胞質內有豐富的線粒體、內質網和少數初級溶酶體（圖2A、圖2B）；微米級二氧化硅組細胞質內未發現高電子密度顆粒及吞飲泡，而細胞間質內可見高電子密度顆粒，可見細胞質內線粒體嵴減少，部分線粒體、內質網擴張；核膜完整。部分細胞凋亡，細胞器結構不清，呈塊狀脫落（圖2C、圖2D）；60 nm二氧化硅組細胞間質和細胞質內可見高電子密度納米二氧化硅顆粒。細胞質中有多個吞噬泡，內含大量輕度團聚的二氧化硅納米粒子，位置靠近核膜邊緣，有膜樣結構，部分膜不完整；可見線粒體嵴減少，線粒體腫脹、滑面內質網、高爾基體擴張；核內異染色質增多。部分細胞凋亡，胞質濃縮，細胞器結構不清，呈塊狀脫落，可見凋亡小體（圖2E、圖2F）；30 nm二氧化硅組細胞間質可見高電子密度納米二氧化硅顆粒。細胞質中有多個吞噬泡；內含大量輕度團聚的納米二氧化硅顆粒，部分位置靠近核膜邊緣，有膜樣結構，部分膜不完整，邊界模糊；包裹在空泡中的納米二氧化硅顆粒聚積成橢圓形或不規則形團塊，密度高于細胞質，與細胞核的電子密度相近。可見線粒體嵴減少，線粒體腫脹、滑面內質網擴張，細胞核腫脹，染色質邊集。部分細胞凋亡，細胞形態不規則，胞質濃縮，呈塊狀脫落，可見凋亡小體。部分細胞核碎裂、溶解，細胞壞死（圖2G、圖2H）；15 nm二氧化硅組細胞間質可見高電子密度團聚納米二氧化硅顆粒。細胞質內可見多個大吞噬泡包裹著納米二氧化硅顆粒，邊緣模糊，未發現膜樣結構。多數靠近細胞核邊緣，部分侵蝕細胞核膜。空泡中的納米二氧化硅顆粒聚積成大片，呈新月形或不規則形等形狀，密度高于細胞質，染色深。可見線粒體嵴減少，線粒體腫脹、滑面內質網擴張（圖2I、圖2J）。

經能譜分析發現，細胞吞噬泡內的顆粒和細胞間隙的顆粒均出現一個明顯的“硅”峰，提示二氧化硅顆粒物直接或間接地與支氣管上皮細胞間發生了作用（圖3）

2.3 DNA損傷檢測結果 熒光顯微鏡觀察可見陰性對照組細胞DNA熒光基本呈圓形，說明DNA損傷較輕；納米二氧化硅組和微米二氧化硅組DNA均可見熒光拖尾現象，說明均存在DNA損傷情況（圖4）。

2.4 對單細胞凝膠電泳圖像進行定量分析結果 與對照組比較，BEAS-2B細胞在刺激24 h后，納米二氧化硅組和微米二氧化硅組的OTM均增加，但以納米二氧化硅組更明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）；納米二氧化硅組和微米二氧化硅組比較，OTM均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

圖 1 經25 mg/mL、50 mg/mL和75 mg/mL的15 nm、30 nm、60 nm和1 μm二氧化硅顆粒物刺激支氣管上皮細胞24 h后的細胞成活率變化，數值采用均數±標準差表示，*代表細胞成活率下降組間比較有統計學差異。Fig 1 The cell viability change of BEAS-2B cells after 24 h exposed to 15 nm, 30 nm, 60 nm, and 1 μm silica particles at 25 mg/mL, 50 mg/mL and 75 mg/mL. Values are Mean±SD from three independent experiments, *P＜0.05, **P＜0.01.

3 討論

3.1 不同粒徑二氧化硅在細胞內生物分布機制 納米顆粒要對細胞產生毒性，必須直接或間接接觸細胞。由于納米顆粒粒徑極小，研究[5-7]顯示，納米顆粒可通過生物膜上的孔隙或細胞的內吞作用進入細胞及細胞器內，與細胞內生物大分子發生相互作用，破壞生物膜和生物大分子的正常空間結構等。

納米顆粒到達肺泡后，還可以穿過肺泡上皮細胞而進入肺間質進入血液循環，或者通過淋巴循環進入血液[8]，顆粒粒徑越小，越容易發生肺外轉移，從而越容易進入血液循環，同時，顆粒粒徑越小，在血循環滯留時間越長，從而更容易隨血液分布到全身各處，對機體可能產生更強的損傷作用[9]。因此，有學者提出越小的納米顆粒越有可能穿透細胞并產生毒性作用[10]，但也有學者指出這種說法是片面的，并不是所有的納米顆粒都能進入細胞，決定納米物質的生物效應的因素非常多，絕不僅僅局限于尺寸。例如納米顆粒的劑量、結構、尺寸、表面電荷、表面修飾、聚集狀態、晶型等。

圖 2 50 mg/mL的二氧化硅顆粒物刺激支氣管上皮細胞24 h后的透射電鏡圖。A、B為對照組，未發現有二氧化硅顆粒物，細胞內有豐富的線粒體；C、D為1 μm二氧化硅顆粒物組，細胞質內未見二氧化硅顆粒物，可見細胞線粒體脊減少；E、F為60 nm二氧化硅顆粒物組，細胞質與細胞間質內可見二氧化硅顆粒物；G、H為30 nm二氧化硅顆粒物組，細胞質內可見二氧化硅顆粒物，部分細胞核碎裂；I、J為15 nm二氧化硅顆粒物組，吞噬泡內可見二氧化硅顆粒物，部分細胞核碎裂。Fig 2 The BEAS-2B cells exposed to Silica particles at 50 mg/mL after 24 h under TEM. A, B are control group, there is no silica particles but abundant mitochondria in cells; C, D are 1 μm silica particles group, there is silica particles in cytoplasm but cristae of mitochondrion reduced; E, F are 60 nm silica group, there is some silica particles in cytoplasm, and some silica particles in interstitial cell; G,H are 30 nm silica particles group, there are some silica particles in cytoplasm, and appear nuclear fragmentation; I, J are 15 nm silica group, there are some silica particles in devour bubble, and appear nuclear fragmentation.

圖 3 單晶沉積區域EDS分析結果Fig 3 The EDS analysis of single crystal deposition region

圖 4 50 mg/mL的二氧化硅處理24 h后，熒光顯微鏡觀察DNA損傷的單細胞凝膠電泳圖片。A：DNA熒光呈圓形；B、C：DNA熒光出現拖尾現象。Fig 4 The DNA damage of BEAS-2B cells detected by Single Cell Gel Electrophoresis under fluorescence microscopy. A: DNA fluorescence show circular; B, C: DNA fluorescence show a smearing.

表 1 不同粒徑二氧化硅處理BEAS-2B 24 h后DNA損傷情況（n=9）Tab 1 DNA damage of BEAS-2B cells treated by different of silica particles at 24 h (n=9)

3.2 不同粒徑二氧化硅導致DNA損傷遺傳毒性機制探討體外細胞實驗[11]發現，石英能夠與DNA發生直接反應。將石英與DNA共同孵育后，石英表面的硅烷醇基與DNA的核苷酸骨架間形成大量氫鍵。電鏡觀察到石英粉塵在上皮細胞核內和有絲分裂的紡錘體中存在。推測石英與DNA的直接反應可能對石英的致癌性起決定作用，石英粉塵上的自由基可能干擾了DNA的復制和修復。Yu等[12]用無細胞系的實驗表明，二氧化硅粉塵可引起λHind III DNA鏈斷裂及堿基的氧化。動物實驗及細胞培養證明，石英粉塵可誘導氧自由基的產生和DNA鏈的斷裂。物理學方法觀察到石英粉塵表面的氧自由基可以與DNA鏈緊密結合, 并在距石英粉塵攻擊的靶堿基數埃的位置對DNA造成損傷[13]。傅立葉變換紅外光譜觀察到：將石英與 DNA共同孵育后，石英顆粒表面的硅烷醇基與DNA的核苷酸骨架間形成大量氫鍵，矽塵可通過氫鍵而使DNA與粒子表面的二氧化硅結合，形成DNA-矽塵附加物，它可定位于DNA上接近氧自由基產生的部位，進而干預復制、修復和（或）DNA表達以及改變有絲分裂過程，產生突變效應而致癌。

我們對BEAS-2B研究發現，微米二氧化硅不能進入細胞，納米二氧化硅可以通過細胞膜進入細胞，賦存在細胞質中，部分可見包裹納米粒子的吞噬泡，部分未見明顯的膜樣結構，邊界模糊。部分包裹納米粒子的吞噬泡侵犯核膜，但未進入細胞核。與上述研究結果不一致，考慮納米二氧化硅對不同種類細胞作用可能不同。

細胞膜是細胞與細胞外環境之間的一種選擇性通透屏障，既能保障細胞對基本營養物質的吸收攝取、代謝廢物的排除和細胞內離子濃度的調節，又能維持細胞相對穩定的內環境。外界物質通過細胞膜轉運主要有：胞吞與胞吐、被動運輸和主動運輸三種方式。納米顆粒如何進入細胞膜，目前研究尚無定論，多數認為納米顆粒主要通過細胞吞噬進入細胞。

細胞的被動運輸分為簡單擴散和協助擴散。簡單擴散是胞外的各種極性分子和無機離子，由高濃度向低濃度自由擴散通過生物膜，不需要細胞提供能量。如O2、CO2、N2、水、尿素、葡萄糖、氨基酸、核苷酸及細胞代謝產物等）。其通透性取決于分子的大小、脂溶性和極性。納米二氧化硅和微米二氧化硅均帶負電，不能通過自由擴散通過細胞膜。另外，納米二氧化硅顆粒雖小，但仍遠大于水分子等可自由擴散的分子直徑，理論上也是無法自由擴散通過生物膜的。

協助擴散需要特異的膜蛋白載體蛋白和通道蛋白協助完成。主動運輸是細胞的選擇性運輸。納米二氧化硅和微米二氧化硅不太可能通過以上兩種方式進入細胞。

真核細胞主要通過胞吞作用，將大分子與顆粒性物質通過細胞膜移入細胞內。胞吞又分為胞飲作用和吞噬作用，胞飲作用只能轉運溶液和小分子物質，形成的囊泡較小（直徑一般小于150 nm），大的顆粒物只能通過吞噬作用運輸，但吞噬泡的形成需要微絲及其結合蛋白的幫助。由于納米顆粒的表面效應，進入生物系統的無機納米粒子會強烈吸附蛋白質分子，甚至改變蛋白質分子的構象[14]因此，不排除被納米二氧化硅吸附的蛋白質分子，向細胞傳遞生物信號，引起細胞吞噬而進入細胞內。微米二氧化硅由于粒徑大，只能由吞噬細胞運輸，上皮細胞不能吞噬。

納米二氧化硅不能進入細胞核，細胞膜具有吞噬作用，但核膜不具此作用，核膜阻擋納米二氧化硅進入細胞核，但吞噬泡包裹的納米粒子有向細胞核靠近趨勢，可能和納米二氧化硅帶負電有關。

有研究[15]發現，納米二氧化硅可以被攝入細胞，一定條件下能進入細胞核，導致Topo I的異常。Park等[16]研究顯示，納米二氧化硅可被吸收至多種細胞的細胞核中，并引起拓撲異構酶I的異常聚集，而微米級二氧化硅只能到達細胞間質，而不能進入細胞質內。這也許是納米顆粒比微米顆粒造成較大DNA損傷的原因。

本實驗發現，納米二氧化硅比微米二氧化硅造成更大的DNA損傷，與上述研究一致，分析納米二氧化硅由于其特殊表面效應和小尺寸效應，進入細胞質并靠近細胞核，通過產生大量自由基，直接或間接作用于DNA，導致DNA損傷。

本研究初步得出而個結論：①微米二氧化硅不能進入細胞，納米二氧化硅賦存在細胞質，二氧化硅的粒徑決定其在細胞內的生物分布；②納米二氧化硅對細胞遺傳毒性比微米二氧化硅更嚴重。