沉默PPAR-γ通過上調bcl-2表達抑制A549細胞凋亡

楊靖宇

肺癌是癌癥引發死亡的第一大原因，2008年在全球范圍內大約造成1,380,000例死亡[1]。根據組織學分類，肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中前者占據肺癌的80%[2]。肺癌預后很差，目前化療仍然是晚期疾病治療的主要手段。鉑類藥物，包括順鉑和卡鉑，是此類疾病化療最常用的藥物，腫瘤細胞對鉑類藥物產生耐藥性是臨床治療失敗的主要原因[3]，克服耐藥性是提高臨床治療效果的迫切需要。鉑類藥物與DNA的堿基結合，干擾DNA合成，抑制腫瘤細胞增殖并誘發細胞凋亡。腫瘤細胞耐受鉑類藥物的機制主要為兩方面，一方面過表達多藥耐藥基因（multidrug resistance genes, MRG）以減少藥物在細胞內的蓄積，另一方面提高腫瘤細胞抗凋亡能力。對這兩種機制涉及的信號通路做深入研究并尋找克服耐藥性的方法一直是癌癥研究的重點。已發現的機制包括Src激酶活性升高誘導MDR1和LRP過表達[4]，PI3K/Akt信號通路異常活躍導致肺癌轉移和耐藥[5]。

PPAR-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）是一種II型核受體，在人類細胞中由PPARG基因編碼。PPAR-γ的基本功能包括調節脂肪酸的儲存和糖代謝，因此臨床上它與肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝疾病密切相關[6]。同時，PPAR-γ還與癌癥密切相關。臨床前研究[7]發現，配體激活PPAR-γ可控制腫瘤的生長，促進細胞凋亡，抑制腫瘤轉移。因此，PPARG被認為是一個抑癌基因，靶向PPAR-γ是治療腫瘤的一個潛在有效的手段。然而，PPAR-γ與腫瘤耐藥的關系尚未得到充分的研究。本文對PPAR-γ沉默后A549順鉑耐藥性的變化進行研究，并對其中的分子機制進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人非小細胞肺癌細胞系A549購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；細胞培養基購自Gibco；PPAR-γ siRNA質粒及對照siRNA質粒均購自Santa Cruz生物技術公司；MTT試劑、RT-PCR試劑盒購自Promega公司；凋亡檢測試劑盒購自BD公司；順鉑購自Sigma公司；抗PPAR-γ、Akt、p-Akt、caspase-3、bcl-2和bax單抗購自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore；流式細胞儀：BD公司，酶標儀：Thermo，PCR儀：Thermo。

1.2 細胞與細胞培養 A549培養于10 cm培養皿，37oC、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，培養基為90% F-12K，10%胎牛血清（FBS）。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有試驗均采用對數生長期細胞。

1.3 PPAR-γ siRNA質粒轉染A549細胞并篩選穩定轉染的細胞克隆 A549培養于6孔板中，按照試劑盒說明書進行轉染。經優化，按照1 μg siRNA Plasmid：1 μL siRNA Plasmid Transfection Reagent的比例配制轉染試劑。當細胞融合程度達到60%-70%時，用2 mL siRNA Transfection Medium洗滌細胞2次，每孔加入0.8 mL siRNA Transfection Medium和0.2 mL上述轉染試劑（含1 μg質粒），繼續培養6 h后，加入1 mL含20% FBS的培養基，繼續培養48 h，吸走培養基，加入含有4 μg/mL嘌呤霉素的選擇培養基。在該濃度的嘌呤霉素下，未經轉染的細胞在4天后即死亡。每隔3-4天更換選擇培養基，直至得到克隆生長的細胞。

1.4 MTT法檢測順鉑對細胞生長的作用 取對數生長期的A549以及克隆細胞，分別以4×104個/mL接種到96孔微孔板中，100 μL/孔，培養過夜使細胞貼壁。向對應試驗孔加入不同濃度的順鉑，繼續培養72 h，吸去培養基，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的F-12K，繼續培養4 h。吸去MTT，加入100 μL DMSO，使MTT結晶完全溶解，最后用酶標儀測定490 nm波長下的OD值，并計算藥物對細胞的抑制率。抑制率＝（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以順鉑濃度的對數為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖并擬合抑制曲線，50%抑制率所對應的化合物濃度即為IC50值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細胞，分別加入10 μmol/L順鉑，繼續于培養箱內培養24 h，然后收集上清及貼壁的細胞。調整細胞濃度至1×106/mL，用凋亡檢測試劑盒染色，最后用流式細胞儀檢測細胞。該試劑盒通過Annexin V與外翻的磷脂酰絲氨酸結合，PI與細胞核結合，檢測凋亡細胞。

1.6 Western blot法檢測細胞PPAR-γ、p-Akt、caspase-3和bcl-2/bax的表達 取對數生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細胞，收集細胞裂解提取蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質以12%SDS-PAGE法分離并轉移至PVDF膜上，以相應的單克隆抗體室溫孵育4 h以檢測目標蛋白。洗去一抗，以HRP連接的二抗室溫孵育2 h，洗滌后以ECL試劑盒顯示免疫反應條帶。β-actin作為內參。

1.7 RT-PCR檢測細胞中PPARG和bcl-2基因的mRNA水平取對數生長期的A549和A549/PPAR-γ(-)細胞，用Trizol法提取各組總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進行逆轉錄得到cDNA。PPAR-γ上游引物序列：5'-ACTGTCGGTTTCA GAAGTGC-3'，下游引物序列：5'-ATGGACACCATACT TGAGC-3'；bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTG GGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGGCAGG CATGTTGACTT-3′；以β-actin為內參，上游引物序列：5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物序列：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。94oC變性3 min后，按下述條件擴增40個循環：95oC、5 s，65oC、35 s，72oC、60 s，循環后72oC延伸5 min。

1.8 數據統計 每組實驗均重復3次，實驗數據以Mean±SD表示，使用SPSS 13.0軟件進行分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 經siRNA轉染的A549細胞克隆表達更低的PPAR-γ PPAR-γ siRNA質粒或對照siRNA質粒轉染的A549細胞，在含有嘌呤霉素的選擇培養基中篩選并克隆化培養。只有成功轉入質粒的細胞方能在選擇培養基中生長。經過克隆增殖后，收集克隆細胞以RT-PCR和Western blot檢測PPAR-γ的表達水平，驗證siRNA沉默效果，最終確定克隆1組和克隆2組。兩個克隆間的沉默水平不同，命名為沉默組1和沉默組2（siRNA-1 group和siRNA-2 group），用于后續研究，如圖1所示，兩例克隆細胞的PPAR-γ蛋白表達量均明顯低于母細胞A549（control group）和空載體陰性對照組（negative group），沉默組PPAR-γ mRNA表達分別為母細胞組的42.6%±2.22%（P＜0.000,1）和28.5%±1.63%（P＜0.000,1），對照siRNA質粒轉染克隆A549細胞的PPAR-γ表達水平保持不變。

2.2 PPAR-γ表達沉默提高細胞對順鉑的耐受性 以母系A549細胞，對照siRNA和PPAR-γ siRNA轉染的細胞為研究對象，通過MTT法分別檢測細胞對順鉑的敏感性（圖2）。試驗結果顯示，對照siRNA轉染的細胞對順鉑的敏感性，IC50為（11.4±0.82）μmol/L，母細胞A549為IC50為（12.3±0.78）μmol/L，相比未發生明顯變化，而PPAR-γ沉默后的細胞對順鉑的耐受性增加，表現為IC50值的升高，沉默組1的 IC50為（14.7±0.97）μmol/L，沉默組2的IC50為（18.2±1.08）μmol/L。

2.3 PPAR-γ表達沉默抑制細胞凋亡 為尋找PPAR-γ沉默后細胞對順鉑耐受性提高的原因，分析對比了順鉑處理后細胞凋亡的比例。流式細胞術檢測結果顯示，在順鉑的作用下，A549的凋亡細胞明顯可見。母細胞組凋亡率為43.2%±2.42%，經PPAR-γ沉默的沉默組1和組2其凋亡細胞比例分別為32.5%±1.73%（P=0.003,4）和25.1%±1.34%（P=0.000,3），明顯低于母細胞組（圖3），這一結果與MTT結果一致，說明細胞對順鉑耐受的提高與細胞抗凋亡能力的提高有關。

2.4 PPAR-γ表達沉默抑制細胞凋亡與Akt磷酸化、caspase-3和bcl-2/bax表達水平上調有關 為進一步探索PPAR-γ調控細胞凋亡的機制，通過Western blot檢測細胞在順鉑處理后Akt磷酸化、caspase-3和bcl-2/bax表達水平。與母細胞相比，沉默組1和沉默組2細胞中Akt磷酸化水平和bcl-2/bax的表達水平明顯上升，caspase-3表達水平明顯下降（圖4）。

2.5 PPAR-γ對bcl-2表達的調控源自基因轉錄水平 RT-PCR分析顯示，相比對照細胞，A549/PPAR-γ(-)在順鉑處理后，bcl-2 mRNA水平明顯上調，分別為母細胞組的156.2%±11.23%（P＜0.000,1）和188.4%±13.46%（P＜0.000,1）（圖5），這一結果與Western blot的結果一致，說明PPAR-γ對bcl-2表達的調控是通過轉錄水平實現的。

圖 1 PPAR-γ沉默表達A549細胞系的構建。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 1 The construction of stably PPAR-γ silencing expression A549 cell lines. The expression of PPAR-γ in A549 cell lines was measured by Western blot (A) and real time PCR (B). #P＞0.05, *P＜0.05.

3 討論

肺癌是全球癌癥的第一原因，也是癌癥的第一死因。鉑類藥物作為肺癌的一線化療藥物，在疾病的治療中表現出一定的效果，但隨著治療時間的推移，腫瘤往往產生耐藥性，導致治療失敗。深入研究腫瘤對鉑類化療藥物產生耐藥的分子機制，并尋找新的可運用于臨床的治療策略，是提高患者臨床受益的迫切需要。

腫瘤細胞對化療藥物產生耐受性的最常見機制有兩種[8]，一種是過表達特定的多藥耐藥蛋白，如MDR1、MRP1等，這些蛋白具有跨膜轉運的功能，可以消耗ATP的方式將藥物從細胞內泵出細胞外，降低藥物在細胞內蓄積和藥靶部位的有效濃度；另一種機制則是針對藥物誘導細胞凋亡的作用特點，腫瘤細胞的分子調控網絡發生一系列的變化，導致細胞抗凋亡能力提高，凋亡減少。

圖 2 PPAR-γ對A549細胞藥物敏感性的抑制作用Fig 2 Inhibition effect of PPAR-γ on A549 cells drug sensitivity

圖 3 PPAR-γ對A549細胞凋亡的抑制作用。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 3 Inhibition effect of PPAR-γ on A549 cells apoptosis. #P＞0.05, *P＜0.05.

圖 4 PPAR-γ對A549細胞凋亡相關基因蛋白表達的影響Fig 4 The effect of PPAR-γ on protein expression of apoptosis-relative gene in A549 cell lines

圖 5 PPAR-γ對A549細胞bcl-2 mRNA表達的影響。#P＞0.05，*P＜0.05。Fig 5 The effect of PPAR-γ on mRNA expression in A549 cell lines. β-actin was used as an internal. #P＞0.05, *P＜0.05.

PPAR-γ屬于PPARs家族的一員，該家族為核轉錄因子，在與相應的配體結合后介導目標基因的表達或者抑制[6]。PPAR-γ高表達于脂肪組織中，它是脂肪細胞分化的主要調控因子[9,10]。同時，PPAR-γ也表達于其它組織中，例如乳腺、結腸、肺、卵巢、前列腺和甲狀腺中[11]。研究進一步發現PPAR-γ與癌癥存在特定關系。在乳腺癌中，PPAR-γ高表達的患者具有更好的無疾病生存期[12]。同樣地，PPAR-γ也表達于小細胞和非小細胞肺癌中[13]。在非小細胞肺癌細胞系中，配體誘導PPAR-γ活化可誘導細胞生長停滯，促進腫瘤細胞分化并誘導凋亡[14-16]。然而，PPAR-γ在腫瘤耐藥中的作用還沒有得到充分的研究。

根據其在腫瘤細胞中的作用，我們推測PPAR-γ的下調可能是腫瘤細胞耐藥的機制之一。因此，本研究中我們首先構建了質粒轉染的可穩定下調PPAR-γ的非小細胞肺癌細胞系A549/PPAR-γ(-)，并通過RT-PCR和Western blot對構建結果進行驗證。隨后的MTT研究結果顯示，A549/PPAR-γ(-)對順鉑的耐受性增加，表現為IC50值升高，并且耐受性與PPAR-γ的表達量成負相關，即PPAR-γ表達越低，耐受性越高。為了進一步地闡明PPAR-γ下調后賦予A549細胞耐藥性的分子機制，根據已知的PPAR-γ在腫瘤細胞中可能發揮的作用，我們利用流式細胞術檢測了腫瘤細胞的凋亡率。結果顯示，腫瘤細胞對順鉑的耐受性提高與凋亡減少密切相關。PPAR-γ作為一個轉錄因子，本身無法直接對細胞凋亡產生影響，必須通過調控與凋亡相關的蛋白表達方能發揮作用。Bcl-2和caspase-3是一個在細胞凋亡中發揮重要作用的蛋白，在很多腫瘤中發現二者的表達與腫瘤的耐藥密切相關[17,18]。本研究發現，在A549/PPAR-γ(-)細胞中，bcl-2的蛋白表達水平明顯升高，caspase-3表達明顯下降，PPAR-γ表達下降致使bcl-2升高和caspase-3上調是腫瘤產生耐藥的主要機制之一。進一步的RT-PCR證實，bcl-2的表達升高是通過bcl-2基因轉錄水平升高實現的，這與PPAR-γ作為轉錄因子的作用特點吻合。另外一個與腫瘤耐藥密切相關的信號通路是PI3K/Akt[5,19]。Western blot研究顯示，A549/PPAR-γ(-)細胞中Akt的磷酸化水平升高，說明在該細胞中，PI3K/Akt的活化也參與到細胞對順鉑的耐藥中，但PPAR-γ如何與PI3K/Akt進行對話尚不清楚，值得深入研究。上述這些調控均體現出與PPAR-γ表達量相關的效應關系。

總之，本研究顯示沉默PPAR-γ可使A549細胞對順鉑的耐受性提高，其機制是通過上調bcl-2表達、增強PI3K/Akt信號通路，進而使得細胞抗藥物誘導凋亡的能力增強。因此，PPAR-γ表達的下降很可能是臨床腫瘤產生耐藥的一種重要甚至是普遍的機制。同時，本研究不排除PPAR-γ還可能通過bcl-2和PI3K/Akt以外的途徑增加腫瘤細胞的耐藥性，值得進一步的研究。