干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2在肺癌中的表達(dá)和意義

許偉 位云艷 譚瑤曦 徐瑋 程雁 吳劍卿

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSCs）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲衍進(jìn)、術(shù)后復(fù)發(fā)、治療療效和腫瘤耐藥等方面發(fā)揮著重要作用。干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子Sox2屬于SOX（SRY-like HMG box）基因家族成員，包含DNA結(jié)合區(qū)HMG，在維持干細(xì)胞的自我更新、多向分化及重編程等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。流行病學(xué)研究[4-7]提示，Sox2基因突變、甲基化或表達(dá)異常與多種癌前病變及腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。同時，研究者在腦膜瘤、骨髓瘤、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌患者的血清中檢測出Sox2自身抗體（Sox2-Ab）水平增高[8,9]。本研究采用實時熒光定量PCR、免疫組化及ELISA法檢測非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者腫瘤組織Sox2表達(dá)和血清Sox2-Ab水平，旨在分析Sox2和Sox2-Ab在NSCLC的表達(dá)和意義，評價Sox2作為肺癌新的標(biāo)志物及治療靶點的價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與處理 收集2010年1月-2013年3月江蘇省腫瘤醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院組織及血清標(biāo)本，包括58例NSCLC（基于2009年國際抗癌聯(lián)盟UICC肺癌TNM分期，腺癌30例和鱗癌28例，表1）、16例其他類型腫瘤（乳腺癌4例、食管鱗癌2例、胃腺癌4例、腸腺癌3例和肝癌3例）以及20例正常肺臟的手術(shù)組織標(biāo)本，術(shù)前均未經(jīng)放化療。病理（痰、胸水、肺活檢及肺泡灌洗液等）確診的肺癌患者治療前血樣30例（腺癌15例和鱗癌15例）及健康體檢者血清30例。該研究得到南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 按照EZNA FREE石蠟組織樣本RNA提取試劑盒提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit合成cDNA。基因庫檢索獲得Sox2基因全長序列，利用軟件Primer primier 5.0，設(shè)計上游引物：5-tggacagttacgcgcacat-3，下游引物：5-cgagtaggacatgctgtaggt-3，擴(kuò)增片段長度為205 bp，引物由上海英俊公司合成。實時熒光定量PCR采用熒光染料IQ SYBR Green Supermix摻入法。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 采用SP法進(jìn)行Sox2免疫組化染色。兔抗人Sox2單克隆抗體為美國CST公司產(chǎn)品，SP試劑盒和DAB顯色劑為美國Zymed公司產(chǎn)品，均購自巴傲得生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色按試劑盒操作說明進(jìn)行，以微波加熱法行抗原修復(fù)，用PBS代替一抗做陰性對照。光學(xué)顯微鏡下高倍鏡觀察Sox蛋白陽性部位位于肺癌細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)廣泛棕黃色和棕褐色顆粒為陽性，以未染色或淡黃色為陰性，并與熒光半定量PCR結(jié)果聯(lián)合分析，400倍光鏡下隨機(jī)選擇10個視野，以平均每個視野超過5%陽性染色細(xì)胞為陽性。

1.2.3 ELISA 采早晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，置于-20oC冰箱待測。血清Sox2-Ab水平應(yīng)用酶標(biāo)儀（Bio-Rad Model680），按照ELISA檢測試劑盒（上海瑤韻生物科技有限公司）說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計及分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件作統(tǒng)計學(xué)處理。陽性率的比較采用χ2檢驗或fisher確切概率法，均數(shù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sox2 mRNA在不同組織中的表達(dá) 實時熒光定量PCR統(tǒng)計結(jié)果表明肺癌組織中Sox2 mRNA表達(dá)明顯高于正常肺組織，前者均值是后者均值的3.93倍，二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.41, P＜0.001），肺癌組織最高者表達(dá)量是正常肺組織均值的24.04倍。同時，Sox2 mRNA表達(dá)高于其他腫瘤組織，其均值是后者的2.11倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.38, P＜0.001）（圖1）。而Sox2 mRNA在其他腫瘤組織和正常肺組織中的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.86, P=0.403）。

2.2 肺癌組織中Sox2 mRNA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 Sox2 mRNA表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)，但與腫瘤的體積和組織學(xué)類型相關(guān)，即Sox2 mRNA在鱗癌的表達(dá)高于腺癌；Sox2 mRNA表達(dá)隨腫瘤體積增高（表1）。

2.3 Sox2蛋白在肺癌組織中的表達(dá) 58例患者肺癌細(xì)胞中，Sox2蛋白陽性表達(dá)39例，陰性表達(dá)19例，20例正常肺組織中Sox2蛋白均為陰性，與肺癌組織比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.6, P＜0.01）（圖2）。

2.4 Sox2-Ab表達(dá)水平 血清Sox2-Ab水平肺癌組（9.32±1.23）ng/mL，對照組（8.29±0.71）ng/mL，肺癌組血清Sox2-Ab均值水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.09）。Sox2-Ab表達(dá)水平在不同年齡、性別、病理類型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

肺癌的發(fā)病率居高不下，死亡率居惡性腫瘤首位。其中，NSCLC約占肺癌的80%，發(fā)現(xiàn)時多是晚期，5年生存率不足15%[10]。因此，探索肺癌的病因和發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點及標(biāo)志物具有重要意義。

表 1 肺癌組織中Sox2 mRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab 1 The relation between expression of Sox2 mRNA in NSCLC

圖 1 實時熒光定量PCR檢測各種組織中Sox2 mRNA的表達(dá)Fig 1 Expression of Sox2 mRNA in tissues by qRT-PCR

圖 2 免疫組化染色檢測肺腺癌、肺鱗癌和正常肺組織中Sox2蛋白表達(dá)（×400）Fig 2 Expression of Sox2 protein in lung adenocarcinoma, squamous carcinoma and normal lung tissue by IHC (×400)

腫瘤干細(xì)胞系是具有干細(xì)胞性質(zhì)的癌細(xì)胞，是腫瘤生長的驅(qū)動力。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox基因所編碼的蛋白參與了早期胚胎形成、神經(jīng)發(fā)育、性別決定、細(xì)胞命運決定乃至腫瘤發(fā)生等重要的生物學(xué)過程。研究[1]證實，Sox基因家族成員之一的Sox2基因?qū)S持胚胎干細(xì)胞的全能性發(fā)揮了關(guān)鍵作用；Sox2協(xié)同Nanog、Oct3/4基因維持胚胎干細(xì)胞自我更新[2]；同時聯(lián)合klf4、c-Myc等基因能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3]。

針對肺癌的研究提示，Sox2系多效性的原癌基因。Sox2誘導(dǎo)鱗癌標(biāo)記腫瘤相關(guān)因子p63和角蛋白6表達(dá)，影響鱗癌的分化、遷移和侵襲[4]，肝細(xì)胞生長因子受體和Sox2擴(kuò)增多見于吸煙的肺鱗癌患者[6]；Sox2調(diào)節(jié)A549肺腺癌側(cè)群細(xì)胞包括c-MYC、WNT1、WNT2和NOTCH1等的246個靶癌基因的表達(dá)，維持A549等肺癌側(cè)群細(xì)胞的腫瘤“干性”[7,11]；全基因組分析研究發(fā)現(xiàn)，Sox2、FGFR1或MYC家族基因擴(kuò)增驅(qū)動小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）的發(fā)生發(fā)展[12,13]；Sox2誘導(dǎo)腫瘤癌信號EGFR及BCL2L1，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、存活[14]；Sox2還是I期肺腺癌預(yù)后不佳的獨立預(yù)測因子，且同復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)[5]。

本研究結(jié)果顯示，Sox2在NSCLC組織中有較高表達(dá)，且鱗癌高于腺癌，而在其他非肺部腫瘤及正常肺組織中表達(dá)較低，提示Sox2在NSCLC中的表達(dá)具有較高的特異性和敏感性，Sox2可作為NSCLC新的標(biāo)志物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Sox2在NSCLC中的表達(dá)與腫瘤體積正相關(guān)，這可能同Sox2誘導(dǎo)下游EGFR、IGF-1信號，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活有關(guān)[14,15]。而Ruan等[16]研究也發(fā)現(xiàn)Sox2表達(dá)相關(guān)于T1膀胱癌腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和級別。

鑒于Sox2的免疫源性，研究者在SCLC患者的血清中檢測出Sox2-Ab，其診斷SCLC的敏感性為33%（95%CI:27%-40%），特異性為97%（95%CI: 94%-99%），有望成為SCLC診斷的特異性生物學(xué)標(biāo)志，但進(jìn)一步研究提示Sox2-Ab水平對SCLC的預(yù)后無明顯影響[8]。乳腺癌研究中，乳腺癌患者血清Sox2-Ab水平明顯高于乳腺良性疾病患者和健康對照者，且Sox2-Ab水平同乳腺癌患者腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，血清Sox2-Ab檢測在區(qū)分良惡性乳腺腫瘤中較組織多肽抗原、癌胚抗原、糖類抗原125及糖類抗原153等腫瘤標(biāo)志物更有價值[9]。

本研究采用常規(guī)的ELISA方法檢測NSCLC患者及健康體檢者血清中Sox2-Ab表達(dá)水平，并沒有陽性發(fā)現(xiàn)，可能同樣本量較小，檢測方法不靈敏，以及肺腺癌患者血清樣本相對較多等因素有關(guān)。另外，本研究中，其他腫瘤組織樣本也以腺癌居多，如乳腺癌、胃腺癌等，可能影響了其他腫瘤的代表性，今后需擴(kuò)大研究樣本，進(jìn)一步證實該結(jié)果。

綜上，Sox2在NSCLC組織中有較高的表達(dá)，肺鱗癌高于肺腺癌，且該表達(dá)同腫瘤體積正相關(guān)。Sox2可能是參與肺癌的發(fā)生發(fā)展重要因素，有望成為肺癌新的標(biāo)志物及治療靶點。