百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動性疲勞作用的研究

張穎捷 杜萬紅 黃春桃 施玲 姜德建 劉小陽 邢紅專

安化黑茶是湖南特有的茶葉品種，我們前期研究表明，安化黑茶具有調(diào)脂、降糖、調(diào)節(jié)免疫等功效［1-4］。目前已有關(guān)于多種茶，包括肉蓯蓉茶、靈芝茶、人參花茶、紅茶、綠茶及普洱茶等及其提取物的抗疲勞研究報(bào)道，但國內(nèi)未見黑茶提取物抗疲勞作用報(bào)道。本研究在前期基礎(chǔ)上，通過建立小鼠運(yùn)動疲勞模型評價(jià)安化黑茶的系列產(chǎn)品(百兩茶)提取物的抗疲勞作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 百兩茶提取物由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然產(chǎn)物研究中心及湖南省茶業(yè)股份有限公司白沙溪茶廠提供。將百兩茶原料處理成碎狀，按每克茶葉加12 ml沸水進(jìn)行提取，沸水浴1 h，精密過濾，冷卻，經(jīng)低溫真空濃縮后冷卻干燥，得百兩茶提取物的粉末。高效液相色譜法檢測其中兒茶素含量19.70%;紫外分光光度法檢測其茶多酚及咖啡因含量分別為48.28%與6.73%。每次實(shí)驗(yàn)取百兩茶提取物1 g，用雙蒸水溶解，濃度20 mg/ml;再分別取上述配置溶液15、7.5 ml配置濃度相應(yīng)為10、5 mg/ml。每次實(shí)驗(yàn)溶劑現(xiàn)配現(xiàn)用。紅景天軟膠囊(廣東長興科技保健有限公司，批號:20110403)，每次實(shí)驗(yàn)取紅景天軟膠囊1 g(內(nèi)含紅景天苷5.8 mg)，用雙蒸水溶解，濃度0.18 mg/ml。溶劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件 雄性ICR(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠50 只，體質(zhì)量25 ～30 g，平均(27.45±2.26)g。由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2011-0003。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SCXK(湘)2010-0008。

1.3 器材與試劑 自動分析生化儀為日本和光純藥工業(yè)株式會社產(chǎn)品;乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、肝糖原(LG)及肌糖原(MG)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 雄性ICR小鼠50只，自由飲水，全價(jià)顆粒飼料飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境，3 d后按小鼠體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法分組:空白對照組(雙蒸水)、陽性對照組(紅景天300 mg/kg)、百兩茶組，其中百兩茶組又分為低、中、高(100、200、400 mg/kg)劑量組，共5組。每組每日灌胃1次，正常對照組每日1次給予灌胃等體積的雙蒸水0.2 ml/10 g，陽性對照組每日1次給予灌胃紅景天提取物300 mg/kg，百兩茶組每日1 次給予灌胃低、中、高(100、200、400 mg/kg)3 種劑量百兩茶提取物。每次灌胃時(shí)間為同一時(shí)間，上午9:00。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 分別在灌胃每周末測量體質(zhì)量，28 d給藥1 h后行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，之后連續(xù)給予灌胃5 d，第5天末次灌胃后行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后通過摘取眼球采血檢測相關(guān)生化指標(biāo)。

1.5.1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)［5］:ICR雄性小鼠50只按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，分別為空白對照組，陽性對照組，百兩茶低劑量組、中劑量組、高劑量組。空白對照組每天給予雙蒸水0.2 ml/10 g，陽性對照組每天給予紅景天提取物300 mg/kg，百兩茶實(shí)驗(yàn)組予以百兩茶水提取物100、200、400 mg/kg，連續(xù)灌胃 28 d，末次灌胃 1 h 后把小鼠放置于電動轉(zhuǎn)棒上(轉(zhuǎn)速為2檔，20 r/min)以15 s不落為準(zhǔn)，觀察各組小鼠的耐力時(shí)間(s)。實(shí)驗(yàn)完成后，將小鼠依次放入籠中正常飼養(yǎng)。

1.5.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)［5］:經(jīng)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)后繼續(xù)灌胃相應(yīng)受試物5 d后，在第5天末次灌胃30 min后，將尾根部負(fù)荷2% ～5%體質(zhì)量鉛絲的小鼠置于高30 cm，寬10 cm的恒溫游泳箱作為負(fù)重游泳的器皿，水深為20 cm，水溫25.0℃ ±0.5℃。記錄前，都使小鼠適應(yīng)環(huán)境2 min，然后開始記錄，終止標(biāo)準(zhǔn)為小鼠頭部浸入水中6～8 s不能游回水面，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間(s)。小鼠游泳后，迅速將其撈出水池，用吹風(fēng)筒吹干即刻采血。每次游泳結(jié)束后，更換新鮮干凈水。

1.5.3 生化指標(biāo)的測定:經(jīng)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)及負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)完成后，撈出擦干，迅速經(jīng)摘取眼球采血，離心，制備血清，備用。將采血后的小鼠立即取肝臟和后腿部的肌肉，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，保存，備用。嚴(yán)格按照試劑盒提供方法檢測血LA、血 BUN、血LDH及LG、MG指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 百兩茶提取物對小鼠體質(zhì)量的影響 4周后各組小鼠活潑，精神狀態(tài)好，皮毛光滑，未見任何不良反應(yīng)。高劑量組給藥第7、14天出現(xiàn)體質(zhì)量增長量明顯低于其他各組;給藥第21天時(shí)，與空白對照組相比，其他各組小鼠體質(zhì)量增長明顯減低;與陽性對照組相比，高劑量組體質(zhì)量明顯降低(P＜0.01);與低、中劑量組相比，高劑量茶組體質(zhì)量明顯降低(P＜0.01);低、中劑量組組間體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，與陽性對照組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。百兩茶提取物對小鼠體重的影響的結(jié)果見表1。

表1 百兩茶提取物對各組小鼠體質(zhì)量的影響±s，g，n=10)

表1 百兩茶提取物對各組小鼠體質(zhì)量的影響±s，g，n=10)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01;與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別 實(shí)驗(yàn)前 第7天 第14天 第21天空白對照組 27.56±0.87 30.64±1.12 32.40±1.14 37.32±1.72陽性對照組 27.39±1.36 31.36±1.71 32.57±1.47 33.84±1.61＊＊低劑量組 27.83±1.48 31.83±1.62 32.89±1.43 33.78±1.11＊＊中劑量組 27.03±1.63 30.49±1.95 31.96±1.36 33.25±1.02＊＊高劑量組 27.14±1.13 29.37±1.11＊＊ 31.02±1.07＊＊△ 32.56±1.04＊＊△

2.2 百兩茶提取物對小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)是反映小鼠耐力的一個(gè)方面，轉(zhuǎn)棒時(shí)間的長短反映動物抗阻力運(yùn)動時(shí)的疲勞程度。如圖1所示，與空白對照組比較，百兩茶提取物中、高劑量組及陽性對照組小鼠可以明顯延長小鼠的轉(zhuǎn)棒時(shí)間(P＜0.05);百兩茶低劑量組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與百兩茶低劑量組相比，百兩茶提取物中、高劑量組及陽性對照組小鼠可以明顯延長小鼠的轉(zhuǎn)棒時(shí)間(P＜0.05);與陽性對照組相比，百兩茶高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著延長(P＜0.01);百兩茶高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間較中劑量組顯著延長(P＜0.05)。

圖1 百兩茶提取物對小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響

2.3 百兩茶提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是反映小鼠運(yùn)動性疲勞程度的指標(biāo)。如表2所示，與空白對照組相比，給藥各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間明顯延長(P＜0.05);與陽性對照組相比，百兩茶高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(P＜0.01);中劑量組無顯著變化(P＞0.05)。與百兩茶中劑量組相比，高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間明顯延長(P＜0.05);百兩茶低、中劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 百兩茶提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響±s，s，n=10)

表2 百兩茶提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響±s，s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，△△P＜0.01;與中劑量組比較，#P＜0.05

組別 負(fù)重游泳時(shí)間空白對照組443.64±24.05陽性對照組 737.23±26.62*低劑量組 541.68±22.31*中劑量組 646.19±36.43*高劑量組 907.41±28.48＊△△#

2.4 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動后BUN、LDH及LA的影響 如表3所示，與空白對照組相比，給藥各組小鼠BUN及LA水平顯著降低(P＜0.01)。與陽性對照組相比，百兩茶高劑量組小鼠運(yùn)動后LA水平降低(P＜0.05);與百兩茶低劑量組相比，百兩茶提取物中、高劑量組小鼠運(yùn)動后LA水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白對照組相比，百兩茶提取物高劑量組LDH活力提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其他給藥各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動后BUN、LDH及LA的影響±s，n=10)

表3 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動后BUN、LDH及LA的影響±s，n=10)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01;與陽性對照組比較，△P＜0.05;與低劑量組比較，#P＜0.05

組別 BUN(mmol/L)LDH(KU/L)LA(U/L)10.34±1.61 3682±443 27.47±4.17陽性對照組 7.36±0.84＊＊ 3795±537 17.02±2.08＊＊低劑量組 8.38±1.71＊＊ 3862±674 21.66±1.27＊＊中劑量組 8.21±1.48＊＊ 3875±137 18.04±1.81＊＊#高劑量組 7.76±1.42＊＊ 4126±524* 13.19±1.23＊＊△#空白對照組

2.5 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動后MG、LG的影響如表4所示，與空白對照組相比，給藥各組LG水平顯著增加(P＜0.01)。與陽性對照組相比，百兩茶高劑量組LG水平顯著增加(P＜0.01);中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與百兩茶低劑量組相比，百兩茶提取物中、高劑量組及陽性對照組LG水平均顯著增加(P＜0.01)。

表4 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動LG、MG的影響(±s，mg/g，n=10)

表4 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動LG、MG的影響(±s，mg/g，n=10)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01;與陽性對照組比較，△△P＜0.01;與低劑量組比較，##P＜0.01

組別LG MG空白對照組3.62±0.696.37±0.61 3.02±1.46陽性對照組 9.32±1.82＊＊ 3.34±1.41低劑量組 7.73±0.66＊＊ 3.08±0.39中劑量組 9.54±0.83＊＊## 3.28±1.37高劑量組 12.11±1.95＊＊△△##

3 討論

疲勞是機(jī)體極其復(fù)雜的生理或病理變化過程，是指腦力或體力到達(dá)一定程度時(shí)必然出現(xiàn)的一種正常生理現(xiàn)象。它既標(biāo)志著機(jī)體原有工作能力的暫時(shí)下降，又可能是機(jī)體發(fā)展到疾病狀態(tài)的先兆。1982年第五屆國際運(yùn)動生化會議統(tǒng)一了疲勞的概念:機(jī)體生理過程不能持續(xù)其功能在一特定水平或各器官不能維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度［6］。疲勞的表現(xiàn)主要是運(yùn)動時(shí)體內(nèi)能量降低和肌肉力量下降，測定機(jī)體持續(xù)運(yùn)動到力竭的時(shí)間可以反映機(jī)體耐力;而負(fù)荷運(yùn)動引起機(jī)體的生化指標(biāo)變化可反映疲勞的程度。從中樞到外周，從整體、組織器官到細(xì)胞分子水平都是疲勞產(chǎn)生的部位，因此抗疲勞藥物研究應(yīng)從不同角度、不同層次進(jìn)行。

3.1 疲勞產(chǎn)生的機(jī)制及茶葉抗疲勞研究 延緩疲勞發(fā)生和促進(jìn)疲勞的恢復(fù)一直是運(yùn)動醫(yī)學(xué)、保健醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)等學(xué)科的研究重點(diǎn)。目前抗疲勞研究主要集中在以下途徑:(1)增加能源物質(zhì)，改善能量代謝而抗疲勞;(2)提高內(nèi)分泌功能，提高激素水平;(3)清除代謝產(chǎn)物而抗疲勞;(4)提高耐缺氧能力，清除自由基而抗疲勞;(5)改善心腦代謝，保護(hù)心肌而抗疲勞。部分化學(xué)藥品和生物制品已經(jīng)被證實(shí)具有提高運(yùn)動能力、延緩和消除疲勞的作用，但由于其無法避免的不良反應(yīng)及所含的興奮劑成分給機(jī)體造成了很大的危害，及其他因素的限制，各種抗疲勞措施在效果上均存在局限性。因此尋找更加安全、有效的抗疲勞物質(zhì)己經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

徐家玉等［7］研究了靈芝茶對小鼠的抗疲勞作用，其結(jié)果顯示靈芝茶對受試小鼠的爬桿時(shí)間均值明顯長于對照組;實(shí)驗(yàn)組(3.3 g/kg)血清BUN含量均值明顯低于對照組。梁勇等［8］在對云南綠茶的抗疲勞作用研究結(jié)果表明與空白對照組相比，綠茶顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)間，降低運(yùn)動后LA含量，LDH活性增加，MG和LG的儲備量增加顯著。張愛香等［9］觀察松果菊苷抗疲勞及抗氧化作用，能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。劉維佳等［10］報(bào)道人參花茶抗疲勞實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示人參花茶能延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，減少小鼠血清BUN產(chǎn)生，減少小鼠血LA含量，但對小鼠LG含量無明顯影響。

3.2 百兩茶提取物對小鼠運(yùn)動耐力的影響 運(yùn)動能力下降是疲勞最直觀表現(xiàn)，包括運(yùn)動時(shí)能量輸出最大功率降低和肌肉力量下降，測定機(jī)體持續(xù)運(yùn)動到力竭的時(shí)間可以反映機(jī)體的耐力。而延長運(yùn)動耐力及提高運(yùn)動強(qiáng)度則是抗疲勞作用最直觀表現(xiàn)。本研究通過轉(zhuǎn)棒和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，反映小鼠抗阻力與耐力運(yùn)動時(shí)疲勞的程度，客觀反映小鼠的運(yùn)動能力及百兩茶提取物抗疲勞作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠灌胃100～400 mg/kg百兩茶提取物能顯著延長小鼠轉(zhuǎn)棒及負(fù)重游泳時(shí)間，其中以高劑量組最為明顯，且優(yōu)于陽性對照組。茶葉中有效成分兒茶酸通過抑制腸道消化酶來減少腸道組織對碳水化合物、蛋白質(zhì)的吸收，加速其在糞便中的排泄，而達(dá)到減輕體質(zhì)量的目的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)百兩茶提取物高劑量組在給藥后第7天表現(xiàn)出延緩體質(zhì)量增加的作用;給藥第21天各給藥組與空白對照組相比體質(zhì)量增長量均減少。

3.3 百兩茶提取物對運(yùn)動性小鼠LA、BUN、LDH的作用 LA是糖酵解的最終產(chǎn)物。劇烈運(yùn)動時(shí)，血LA濃度增高，其在體內(nèi)堆積過多會直接或間接引起肌肉運(yùn)動能力下降，這是運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生的重要因素之一。因此，LA被作為判斷疲勞程度、有氧代謝能力、控制運(yùn)動強(qiáng)度等的重要指標(biāo)［11］。BUN反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平及其承受運(yùn)動強(qiáng)度的能力。大強(qiáng)度運(yùn)動時(shí)蛋白質(zhì)將作為能量，從而使血BUN生成增多，因此將血BUN作為判斷運(yùn)動強(qiáng)度大小及疲勞程度的監(jiān)測指標(biāo)。BUN與機(jī)體對耐力運(yùn)動適應(yīng)性成反比。LDH是糖代謝過程重要的一類氧化還原酶，運(yùn)動狀態(tài)下，骨骼肌在無氧酵解時(shí)產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸在LDH催化下才能還原成LA，從而使糖酵解產(chǎn)生ATP途徑得以順利進(jìn)行。因此通常將LDH活性作為評價(jià)機(jī)體無氧代謝能力的指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體在正常情況下，血漿LDH活性維持一種穩(wěn)定狀態(tài);機(jī)體在長時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動時(shí)，血LDH活性增高，繼而加速LA的分解，從而達(dá)到消除疲勞的作用［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠灌胃100～400 mg/kg百兩茶提取物能顯著降低血LA及BUN水平，其中以高劑量組最為明顯。高劑量百兩茶提取物能顯著提高LDH活性。與陽性對照組相比，百兩茶提取物中、高劑量組降低BUN水平作用更明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，百兩茶提取物通過降低LA生成、加快LA清除速度、提高耐力運(yùn)動的適應(yīng)性，增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞的能力。

3.4 百兩茶提取物對運(yùn)動性小鼠糖代謝的作用 糖原是大強(qiáng)度運(yùn)動的主要能量來源，它既能以無氧酵解方式又能以有氧代謝方式再合成ATP。機(jī)體功能的衰竭總是和糖原的耗竭同時(shí)發(fā)生，因此糖原的含量能說明疲勞發(fā)生的快慢或程度。MG的動用有利于提高運(yùn)動輸出功率，MG含量越高，抗低氧能力及運(yùn)動耐力愈強(qiáng)。短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動時(shí)，MG酵解提供能量，產(chǎn)生大量LA，而LA的大量堆積則限制運(yùn)動強(qiáng)度提高。MG消耗時(shí)，LG分解為葡萄糖釋放到血液，以維持血糖濃度相對穩(wěn)定。因此，LG與長時(shí)間耐力運(yùn)動也存在密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠灌胃100～400 mg/kg百兩茶提取物，能顯著提高LG水平;百兩茶提取物能使LG儲備能力增強(qiáng);而MG變化不明顯，可能與實(shí)驗(yàn)運(yùn)動強(qiáng)度未至力竭有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明百兩茶提取物可加快LA清除與減少其產(chǎn)生，降低LA的堆積，提高小鼠的運(yùn)動能力與機(jī)體對高強(qiáng)度運(yùn)動的適應(yīng)性;增加小鼠LG的貯備能力，延長耐力運(yùn)動時(shí)間。

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