雌激素及精氨酸對去卵巢大鼠血清一氧化氮水平的影響

景秀菊 祁秀娟 劉建新 湯秀明 劉海寧 趙頻

雌激素與心血管疾病的關系已經爭論了半個世紀。絕經前女性冠心病(CHD)的發病率僅為男性的1/10至3/10，隨著年齡增長，女性CHD發病率增高，55～70歲漸達高峰，以致兩性患者CHD發生率的差異趨于縮小。絕經后女性采用雌激素替代療法，冠脈事件可減少30%～40%。雌激素可能通過影響脂質代謝、糖代謝、血壓等方面起到保護心血管的作用，但并不能全面深入地解釋其對心血管的保護機制。既往臨床試驗提示口服一氧化氮(NO)前體L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)對冠心病患者、高脂血癥患者、健康老年人、青年吸煙者的內皮功能可以產生影響。口服LArg是否可改善內皮功能，尚存爭議。本研究選用2種干預因素雌激素、L-Arg來探討其對大鼠動脈粥樣硬化發生發展的影響。從NO、動脈內皮組織病理變化等角度來探討不同干預因素的作用，從而為臨床探索絕經后安全有效的預防保健措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 3月齡雌性Wistar大鼠40只(購自山東魯抗醫藥股份有限公司)，平均體質量為(214.83±10.72)g，分籠飼養，飼養條件符合國家實驗動物的飼養標準，實驗期間普通飼料飼養，每日光照12 h。隨機分為假手術組(A組)、雙側卵巢切除組(B組)、雙側卵巢切除＋苯甲酸雌二醇(E2)治療組(C組)、雙側卵巢切除＋E2＋L-Arg治療組(D組)，每組10只。實驗前大鼠E2的含量分別為:A組為(38.66 ±3.89)pg/ml、B 組(37.88 ±2.96)pg/ml、C 組(39.39 ± 2.29)pg/ml、D 組(38.89 ± 3.32)pg/ml，各組差異無統計學意義 (P＞0.05)。動物去勢:10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.3 ml/kg，于無菌條件下在背部正中切開，進入腹腔在腎下極附近找到卵巢，用4號絲線結扎并摘除雙側卵巢，分層縫合切口。A組僅找到卵巢后即關腹分層縫合切口。術后連續3 d給予青霉素80萬U肌注預防感染。術后第3天起連續4 d經陰道做細胞涂片，無角化者證實雙側卵巢切除完全，否則棄去不用。術后1周根據組別給予不同的干預措施，連續4月。動物給藥:A組:每3 d肌注，生理鹽水0.04 ml;B組:每3 d肌注，生理鹽水0.04 ml;C組:E210 μg/d，每 3 d 肌注;D 組:E210 μg/d，每 3 d 肌注，每天2.25%L-Arg飲水。

1.2 標本取材 術后4月，用注射器心臟取血3 ml左右，3000 r/min，15 min，取上層血清，置-20℃冰箱保存備用。剪下胸主動脈約3 cm，立即用10%中性福爾馬林固定。

1.3 血清E2、NO、L-Arg濃度的測定 采用北京北方生物技術研究所提供的E2放射免疫分析試劑盒測定各組大鼠血清E2含量;采用南京建成生物工程研究所提供的硝酸還原酶法NO試劑盒檢測各組大鼠血清NO含量，按試劑盒操作說明檢測。L-Arg采用高效液相色譜法測定(Agilent1100、美國安捷倫公司)［1］。

1.4 主動脈組織切片觀察 從10%中性福爾馬林液中取出浸泡的胸主動脈，常規石蠟包埋、切片(5 μm厚)，并將切片行HE常規染色，于顯微鏡下觀察內膜厚度。

1.5 統計學處理 數據以均數±標準差表示，多組樣本均數的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。所有統計分析均采用SPSS 18.0統計軟件進行處理。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗期間D組因麻醉意外死亡1只。其余各組存活良好，未見異常反應。

2.1 4月后各組E2、L-Arg、NO水平比較 B組E2和A組比較顯著降低，差異有統計學意義，表明大鼠去勢成功。C組E2和A組比較差異無統計學意義，表明大鼠去勢后適當補充E2后可使體內E2水平增加，并可以接近未去勢大鼠的E2水平。D組E2和C組比較差異無統計學意義，表明補充外源性L-Arg對血清E2水平沒有影響。

B組L-Arg濃度和A組相比差異無統計學意義，表明去卵巢并不影響血清L-Arg水平。B組L-Arg和C組相比較差異無統計學意義，表明補充雌激素對血清L-Arg水平沒有影響。D組L-Arg水平和C組相比顯著增加，差異有統計學意義，表明補充外源性L-Arg增加了血清L-Arg水平。

B組NO濃度和A組比較顯著降低，差異有統計學意義，提示去卵巢顯著降低了大鼠血清NO水平。A組NO和C組比較無統計學差異，說明補充E2后血清NO增加至假手術組水平。D組NO濃度和C組比較顯著升高差異有統計學意義，說明補充L-Arg可以顯著增加血清NO水平。見表1。

表1 各組E2、L-Arg、NO比較(±s)

表1 各組E2、L-Arg、NO比較(±s)

注:與其他3組比較，*P＜0.05;與C組比較，△P＜0.05

組別 n E2(pg/ml) L-Arg(μmol/L)NO(μmol/L)A組10 42.33±2.77 48.50±2.55 42.87±3.74 B組 10 10.43±2.31* 47.90±3.67 30.19±3.02*C組 10 41.03±3.39 48.00±3.02 40.89±3.07 D組 9 43.50±4.34 92.75±10.09△ 47.05±2.34△

2.2 胸主動脈的形態學觀察 3月齡大鼠胸主動脈HE染色后在光鏡下觀察:A組、C組、D組、胸主動脈壁層次清晰，內膜薄，中層平滑肌層均勻無萎縮，厚度正常，各組之間未見明顯差異;B組和以上各組相比，內膜增厚，內皮細胞不完整，未見明顯脂質沉積(圖1)。

圖1 各組大鼠胸主動脈形態學觀察(×400)

3 討論

1980年Furchgott和Zawadski發現了血管內皮依賴性舒張現象，提出了內皮依賴性舒張因子(endothelium derived relaxing factors，EDRF)的概念，1987年Palmer證實NO與EDRF具有相同的化學性質，現已知EDRF即為NO。NO是內皮細胞合成的最重要的血管活性物質，它不但有強大的擴張血管作用，而且有抑制血小板聚集、平滑肌細胞增生、單核細胞黏附和黏附分子表達的作用，從而可防止血管壁發生粥樣硬化和血栓形成。

3.1 本實驗采用雙側卵巢切除的大鼠模擬絕經模型 卵巢切除后血清E2濃度顯著降低，反映了人工絕經后的狀態，實驗結果顯示血清NO與E2水平呈正相關:去勢大鼠隨著E2水平的下降，血清NO水平明顯降低，明顯低于未切除卵巢大鼠(A組);去卵巢大鼠接受E2治療后，血清NO水平升高接近未切除卵巢組，這和以前的眾多文獻報道結果一致［2-4］。補充E2使血清NO水平升高提示E2可能通過NO途徑產生心血管保護效應。另外，發現3月齡A組、C組之間主動脈內膜形態學未見明顯差異，而B組和A組比較內膜增厚，內皮細胞不完整。C、D組之間主動脈內膜病變未見明顯差異。E2能增加NO合成或釋放的機制還不十分清楚。目前大家公認的有:(1)“基因組效應”機制［5］，即經典機制。E2與胞質受體結合，形成激素受體復合物進入細胞核，進而與核內受體結合，轉變為激素-核受體復合物，調節基因表達。此種機制發揮作用通常需要數小時。(2)“非基因組效應”機制［6-8］，即快速信號通路:E2通過位于細胞膜上或者毗鄰細胞膜的內質網，或者其他相關的雌激素結合蛋白，引起細胞應答反應而發揮效應。此種機制發揮作用只需幾秒或幾分時間。此外還有雌激素-磷酸肌醇-3激酶-絲氨酸-蘇氨酸—內皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路［9］。E2的應用可改善全身及局部癥狀的作用已被確定［10］，有研究發現，應用E2可降低絕經后婦女的骨轉移率［11］。

3.2 藥理研究發現 L-Arg是NO的生理性前提，在體內L-Arg和氧分子在NOS催化下生成NO和L-瓜氨酸而發揮生物學效應［12］。最近，L-Arg對血管內皮作用的研究正日益受到科學工作者的廣泛關注。人們對L-Arg寄予厚望，以期能以之改善內皮功能，預防及治療心血管疾病。Boger等［13］對L-Arg-NO途徑進行了較多的研究，他們將雄性家兔分為普通喂飼組、高脂喂飼組、高脂喂飼加L-Arg組，喂飼12周，以尿硝酸鹽濃度表示體內NO的水平，結果顯示L-Arg組尿硝酸鹽濃度增加。本實驗比較各組血清水平的結果表明:去勢或絕經后血清NO低水平存在，提示絕經后提高NO水平的必要性;去卵巢大鼠接受E2治療后，血清NO水平升高接近未切除卵巢組;補充外源性L-Arg亦可明顯提高血清NO水平，此為外源性L-Arg作為體內NO供體的應用提供了實驗依據。L-Arg的功效依賴于最初的內皮健康狀況。也就是說，基線血流介導的血管舒張越低，L-Arg改善內皮功能的作用越顯著。LArg改善內皮功能的作用機制可能與增加NO釋放，抑制血小板活化，血栓形成和抑制血管平滑肌細胞增殖有關。

目前許多學者對正常人、高膽固醇患者及動物實驗中L-Arg濃度的報道各異。Post等［14］對65名健康的絕經后婦女進行了雌激素替代及安慰劑對照實驗，結果發現雌激素治療組血清精氨酸濃度與對照組相比降低(P=0.05);Verhoeven等［15］對152名健康絕經婦女進行了類似實驗，結果提示雌激素治療組血清精氨酸濃度較對照組顯著降低(P＜0.05)，同時以上實驗發現雌激素治療組血清ADMA(內源性NOS抑制劑)顯著降低。由于2個實驗均未測NO濃度，實驗設計者推測雌激素治療組L-Arg濃度降低是由于雌激素降低了ADMA對NOS的抑制作用，致使L-Arg生成NO消耗增多所致。Xiong等［16］比較了6月齡及20月齡雄性SD大鼠的血清L-Arg濃度結果差異無統計學意義。本實驗A、B、C組間L-Arg濃度未發現明顯差異，L-Arg濃度是否存在統計學差異尚需進一步大樣本實驗研究。

L-Arg是生成NO的前體，L-Arg來源不足、轉運障礙或代謝異常都可影響NO的生成，應該指出的是，在體內L-Arg易被肝臟攝取而進入鳥氨酸循環。因此，合成可選擇性地易被內皮細胞攝取的、高效和長效的L-Arg衍生物，將有助于L-Arg在心血管疾病治療中的廣泛、有效的應用。

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