福州市發生由木爾坦棉花曲葉病毒引起的朱槿曲葉病

章松柏， 夏宣喜， 張 潔， 張友軍， 吳祖建＊

（1.福建農林大學植物病毒研究所，福州 350002；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.長江大學農學院，荊州 434025）

棉花曲葉?。╟otton leaf curl disease）是世界棉花生產上最具毀滅性的病毒病害，已在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國棉花產區廣泛流行，僅在1992－1997年期間就造成巴基斯坦經濟損失累計達50億美元［1－4］。棉花曲葉病是多種雙生病毒引起，這些雙生病毒都屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員［3，5－6］，皆由煙粉虱［Bemisia tabaci （Genn.）］以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，但不能通過機械摩擦接種傳播和種子帶毒傳播；其基因組僅含有DNA－A組分，并伴隨衛星β分子［3－4］。鑒于棉花曲葉病的危害性，2007年5月28日正式發布實施的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中，再次將其列入植物檢疫對象。盡管如此，棉花曲葉病的主要病原之一，木爾坦棉花曲葉病毒，還是很快在我國朱槿（Hibiscus rosa－sinensis Linn.）植物上被發現［7］，經過不到8年的擴散，該病毒已經在我國廣東、廣西、海南等省多個地理區域的多種植物上流行危害，其他省市，包括我國長江流域、黃河流域和西北內陸三大棉花產區尚未發現棉花曲葉病［7－11］。因此，密切監視和防控CLCuMV引起的病害擴散是各級植保植檢部門和科研工作者的重要任務。2011－2012年，實驗室科研人員先后于福建省廈門、福州、寧德等市公路綠化帶發現朱槿曲葉病疑似病株，并詳細調查了該病在福州市的發生情況。經過調查發現福州市城市道路、公園、工廠、學校、政府機關等多數存在朱槿植物的綠化帶以及位于市郊的絕大多數苗圃基地皆存在疑似病株，經過分子檢測和序列比較，證實該病害病原為木爾坦棉花曲葉病毒，傳毒介體為B型煙粉虱，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

植物樣品：朱槿曲葉病疑似病株葉片和健株葉片采集于福州市郊區苗圃基地，液氮速凍后保存于－70℃超低溫冰箱中備用，陽性對照樣品為已經鑒定的苧麻花葉病毒病病株。

介體昆蟲：煙粉虱種群分別采自福州市郊區朱槿健株和疑似病株以及煙草上，收集于含75%乙醇的1.5mL離心管中，保存于－70℃超低溫冰箱或－20℃冰箱中備用。

1.2 實地調查和癥狀觀察

調查福州市種植朱槿的公園、道路、單位和苗圃基地，走訪苗圃基地花農，記錄朱槿曲葉病的發生時間和可能的傳入途徑；對照健康植株，觀察發病朱槿植株葉片是否畸形和黃化，葉片大小是否變化，葉背有無耳突，葉脈是否增厚等，植株是否矮化等。

1.3 植物總DNA和煙粉虱DNA的提取

采用周雪平等報道的CTAB提取法［12］提取朱槿葉片中的總DNA（總共有14份植物樣品，包括病葉樣品12份、健葉樣品1份，對照樣品1份）。

煙粉虱生物型的鑒定使用多頭昆蟲（30～50頭）提取的DNA，方法如下：將煙粉虱置于1.5mL離心管中，液氮速凍后，用研磨棒研磨成粉狀，加入含200μL 堿 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，20mmol／L NaCl，1mmol／L EDTA，1%SDS）和1μL蛋白酶K（終濃度1μg／mL），55℃水浴鍋中水浴2～3h；離心（12000r／min，下同）5min后取上清，加入200μL 24∶1的氯仿／異戊醇抽提，重復1次；離心5min后取上清，加入等體積的異丙醇，－20℃放置20min；離心10min，去上清，沉淀用70%乙醇洗1次，然后將DNA沉淀室溫晾干，加入60μL ddH2O溶解后即可用于PCR反應。煙粉虱帶毒率監測使用朱槿曲葉病病株上采集的煙粉虱，單頭煙粉虱總DNA的提取方法參照潘慧鵬等［13］。

1.4 PCR擴增和電泳

利用Shatters等［14］基于B型和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段設計的PCR擴增特異性引物來鑒定煙粉虱的生物型是B型還是Q型；利用謝艷等［15－16］設計的雙生病毒通用引物來檢測福州朱槿曲葉病是否由雙生病毒引起，并在序列分析的基礎上設計擴增DNA－A余下片段的引物。PCR熱循環程序為：94℃4min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，共35個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物用1.0%瓊脂糖（0.5×TBE）電泳檢測，BioRad凝膠成像儀觀察，記錄結果。

1.5 檢測片段克隆和序列分析

雙生病毒通用引物PCR擴增所得的檢測片段連接pMD 18－T （TaKaRa），轉化克隆驗證后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序。運用DNAMAN軟件（Lynnon Biosoft Inc.）對所獲序列進行加工整理和同源性分析。

2 結果與分析

2.1 福州市朱槿曲葉病危害現狀

通過與苗圃基地花農們座談得知，福州朱槿苗木最初由廣東調運而來，隨后經過枝條扦插繁殖而擴大種植；朱槿疑似曲葉病最早發生于2009年，當時只有零星苗圃發生，經過3年時間已經擴散至福州市各苗圃基地、多數綠化帶以及周邊縣市。因此，推測該病隨苗木調運而傳入福州地區。福州市朱槿曲葉病發病癥狀和已報道的朱槿曲葉病癥狀一致，如封面所示：發病朱槿植株和枝條都明顯矮化；新葉黃化明顯；葉片畸形，變小，老葉和新葉皆向上卷曲，呈杯狀或勺狀；葉脈增大、明脈或脈突，葉片背面粗糙不平且于葉脈處產生耳突；較大的朱槿病株都能正常開花，但花較健康略小，但較小的苗木多數不能正常開花。

2.2 朱槿曲葉病的PCR檢測和鑒定

應用雙生病毒的通用引物（PA／PB）對檢測樣品進行PCR擴增，樣品1～12號都能得到預期約480bp大小的片段（見圖1）。選擇樣品1～6進行測序，檢測片段的序列完全一致。在此基礎上設計引物擴增DNA－A余下約2260bp片段（以樣品1～6的總DNA為模板，擴增結果如圖1中13～18泳道），并予以測序。DNA－A全長序列（GenBank登錄號：JX861210）分析比較如圖2所示，在引起棉花曲葉病的8種病毒中，檢測樣品的DNA－A序列與CLCuMV相似性最高，其中與CLCuMV廣東分離物（JX286664）和廣西分離物（JQ317603）的相似性高達99.6%以上，說明引起福州朱槿曲葉病的病原是CLCuMV。

圖1 福州朱槿曲葉病的PCR檢測及DNA－A的擴增Fig.1 PCR detection of leaf curl disease on H.rosa－sinensis plants and PCR amplification of the geminivirus DNA－A

圖2 基于雙生病毒的DNA－A核酸全序列構建的親緣關系樹Fig.2 Phylogenetic tree based on complete sequence of Begomovirus DNA－A

2.3 煙粉虱生物型鑒定和煙粉虱帶毒率檢測

煙粉虱生物型鑒定應用相應的特異性引物進行PCR擴增，結果如圖3所示，用鑒定B型煙粉虱的特異性引物PCR擴增能得到預期的、約480 bp大小的DNA產物（B1～B6），而用鑒定Q型的特異性引物進行PCR擴增，未得到預期的、約300bp大小的DNA帶條（Q1～Q6），說明采集于煙草和健康或發病朱槿上的煙粉虱生物型是B型。

朱槿病株上煙粉虱的帶毒率應用引物PA／PB進行PCR擴增，以已經鑒定的病株和健株上采集的煙粉虱分別做陽性和陰性對照，結果如圖4所示。22頭朱槿病株上采集的煙粉虱樣品PCR擴增皆能得到預期的、約480bp大小的DNA條帶，所檢測的煙粉虱帶毒率100%，說明煙粉虱的帶毒效率很高。

3 討論

試驗證實福州市朱槿曲葉病是由CLCuMV侵染引起的。CLCuMV是引起棉花曲葉病的主要病原之一，而棉花曲葉病是棉花生產上最具毀滅性的病毒病害，多次在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國棉花產區暴發流行，造成巨大的經濟損失［3－4］。已報道從棉花曲葉病樣中檢測到8種雙生病毒［3，8］，分別為木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMV）、阿拉巴德棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Alabad virus，CLCuAV）、Kokhran棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Kokhran virus，CLCuKV）、番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl virus，PaLCuV）、杰濟拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV）、拉賈斯坦棉花曲葉病毒 （Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRV）、班加羅爾番茄曲葉病毒 （Tomato leaf curl Bangalore virus，ToLCBV）和布里瓦拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Burewala virus，CLCuBuV），這8種病毒在自然條件下由煙粉虱以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，不能通過其他方式傳播，自然寄主包括棉花、黃秋葵、朱槿、垂花懸鈴花和蔟生黃麻等植物［8］。目前，我國長江流域、黃河流域和西北內陸三大棉花產區尚未發現棉花曲葉病毒危害，但在廣東、廣西、海南3省已經發現CLCuMV危害朱槿、黃秋葵等植物，危害范圍日益擴大［7－11］。與廣西情況相似［8］，福建的朱槿苗木最初也是主要來源于廣東，經過若干年的發展，朱槿已經成為城市公路、公園、工廠、學校、政府機關等常用的綠化植物。由于CLCuMV福州分離物DNA－A與廣東分離物的相似性高達99.6%以上，推測CLCuMV可能是通過朱槿的苗木調運而從廣東省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV經過B型煙粉虱在苗圃間傳播，同時病枝扦插繁殖、苗木交易加速了病毒病的發生和蔓延擴散。更為重要的是，朱槿和棉花同屬錦葵科，且我國廣西已經發現有CLCuMV危害棉花的報道［17］，如果該病毒分離物一旦入侵棉區，勢必造成嚴重后果。此外，試驗也驗證了福州市朱槿曲葉病病株上煙粉虱的生物型是B型，該生物型是我國煙粉虱種群中的優勢種，南北多數省市均有分布，攜帶和傳播棉花曲葉病毒的能力較強。因此有必要在廣東、廣西、海南、福建等省開展對木爾坦棉花曲葉病毒引起的植物病害綜合治理研究，以控制其擴散和蔓延，特別要警惕CLCuMV隨煙粉虱傳播、擴散至內陸棉區暴發流行。

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