PATHFAST檢測系統檢測高敏感心肌肌鈣蛋白I的分析性能評價

唐紅霞，賈克剛，韓雪晶，何 聰，尚子軼，甄 利

(天津醫科大學泰達國際心血管病醫院檢驗科，天津 300457)

急性心肌梗死(AMI)目前已成為最常見的心臟疾病。高敏心肌肌鈣蛋白是目前反映心肌損傷最敏感和最特異的生物學標志物，廣泛用于AMI的早期診治[1]。即時檢驗(POCT)平臺PATHFAST全自動化學發光酶免疫分析儀(簡稱PATHFAST)檢測高敏心肌肌鈣蛋白I(hs-cTnI)因其快速和簡便易用而成為常用方法。該儀器使用了高靈敏度的化學發光酶免疫方法，以CDP-Star/Sapphire-Ⅱ為化學發光底物，采用磁珠分離純化技術。這樣未結合到磁珠上的非被檢物可以在一次性吸液管內通過少量的緩沖液沖洗而被分離剔除來實現快速檢測。我們依據ISO15189《醫學實驗室質量和能力認可》的要求[2]，參考美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)發布的 EP17-A、EP5-A2、EP6-A文件[3-5]、美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)C28-A2 文 件[6]和 傳 統 方 法[7-8]，對PATHFAST進行了分析性能驗證。

材料和方法

一、對象

1.hs-cTnI低值樣品組 收集無心血管、肺、腎、肝、膽、胰等器質性疾病;心電圖檢查均正常;均無急性炎癥;半年內均無輸血和大手術史;血清肌酐和血脂正常;隨訪半年內均無心血管事件發生的健康人群100名的血漿，年齡18～85歲，其中男65名，女35名，檢測10次取均值定值。

2.hs-cTnI高值樣品組 收集泰達國際心血管病醫院2011年9月至2012年3月急診和心血管疾病重癥監護病房(CCU)住院AMI患者共100例的血漿，檢測10次取均值定值。AMI患者確診依據歐洲心臟病學會(ESC)、美國心臟病學會(ACC)、美國心臟協會(AHA)和世界心臟聯盟(WHF)2007年心肌梗死的診斷標準[9]。

二、方法

1.樣品采集 所有樣品采集后1 h內分離血漿，－80℃保存，僅凍融1次。

2.儀器和試劑 PATHFAST及原裝配套hs-cTnI試劑盒(批號 E032)、cTnI校準品(批號E032)由日本三菱化學(Mitsubishi Kagaku Iatron)公司生產。

3.功能靈敏度(FS)評估 收集AMI患者的hs-cTnI高值血漿樣品(cTnI濃度約1.0 ng/mL)3 mL，健康人hs-cTnI低值新鮮混合血漿40 mL。以1∶9的比例將高值樣品稀釋至0.10 ng/mL，共30 mL原液。檢測原液3次取均值，用原液配制出最終理論濃度(由高到低)分別為 0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 ng/mL。將上述系列濃度血漿各分裝10套，－80℃冷凍保存至分析。每天檢測1套系列濃度血漿，由同一名操作熟練的工作人員連續檢測10 d，計算天間變異系數(CV)，以hs-cTnI系列濃度為橫坐標、CV為縱坐標作圖，求取CV=10%時的 hs-cTnI濃度值，設為該方法的 FS[8]。

4.精密度評估 參照CLSI EP5-A2文件評估精密度。用健康人hs-cTnI低值新鮮混合血漿稀釋hs-cTnI高值樣品，配制濃度分別為0.025 ng/mL(L)、0.65 ng/mL(M)和2.65 ng/mL(H)的樣品，各分裝10套，－80℃冷凍保存至分析。1 d內由1名操作熟練的工作人員連續檢測20次，評估批內不精密度(CV)。每天取出L、M、H各1套，早晚各檢測1次，由同一名操作熟練的工作人員連續檢測10 d，評估批間不精密度。分別計算批內、批間檢測值的均值()、標準差(s)及CV。

5.空白限(LoB)評估 參照CLSI EP17-A文件確定LoB。每天上、下午各測定一批空白樣品(S0或樣品稀釋液)，每批重復測定3次，由同一名操作熟練的工作人員連續10 d，共獲得60個測量結果。因儀器直接報告的是濃度值，hs-cTnI在低濃度時往往不呈正態分布，故采用非參數方法估計第95百分位數，即將數據由小到大排列，第95百分位數所在位置為空白樣品總數×(95/100)+0.5。

6.檢出限(LoD)評估 參照CLSI EP17-A文件確定 LoD。用樣品稀釋液對 cTnI濃度為0.1 ng/mL的新鮮血漿做系列稀釋，配制成一系列低濃度樣品，其理論濃度分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.020、0.030、0.040 ng/mL，介于預期檢測限濃度的1～4倍。系列低濃度樣品每天上、下午各檢測1次，由同一名操作熟練的工作人員連續檢測5 d，共獲得80個測量結果。因低濃度檢測數值常呈非正態分布，故采用非參數方法確定 LoD。LoD=LoB+DS·β，式中 DS·β是低濃度樣品測定中位數和第5個百分位數的間距，中位數=檢測樣品總數×0.5+0.5，第5百分位數的值=檢測樣品總數×0.05+0.5。

7.定量檢測限(LoQ)評估 參照CLSI EP17-A文件，依據臨床要求和室間質量評價的允許誤差，設定本實驗室hs-cTnI的總誤差目標，在不考慮分析偏差的條件下，總誤差=2CV，如果低濃度樣品的CV≤1/2總誤差，則LoQ=LoD。

8.傳統方法評估檢測低限(LLD)LLD為樣品單次檢測可以達到的檢測相應量對應的分析物量。按照國際純粹和應用化學聯合會的規定，在測量置信水平為99.7%時，方法的LLD由公式LLD=S0+3s空白計算，式中s空白為10次空白測定的s。

9.傳統方法評估生物檢測限(BLD) 在測量置信水平為99.7%且低濃度樣品的檢測相應量都比空白檢測相應量大時，樣品中所具有的分析物濃度即為BLD。在系列低濃度實驗樣品中，某濃度的測定值均值減去3倍該樣品濃度值的s，剛大于LLD值時對應的濃度即為BLD。

10.線性范圍評估 參照CLSI EP6-A文件中對線性評價實驗的要求，取高濃度值cTnI樣品和正常人血漿樣品各1 份，按照1∶3、2∶2、3∶1 的比例混合，分別編號，隨機排列重復測定2次，計算平均值作為最終的測定值，與設定值做線性對比。

11.生物參考區間驗證 按NCCLS C28-A2推薦方法，選擇健康參考個體20名，采集符合要求的樣品，按儀器標準操作程序(SOP)要求進行規范檢測并對檢測結果進行逐一驗證是否落在現用參考區間內。

三、統計學方法

結 果

一、FS評估

表1 hs-cTnI低濃度樣品測定結果及CV

圖1 hs-cTnI檢測濃度與CV的關系

二、精密度評估

高、中、低3個濃度混合血漿批內、批間檢測不精密度結果見表2。高值樣品(2.65 ng/mL)批內CV和批間CV分別為4.70%、5.05%，中值樣品(0.65 ng/mL)批內 CV和批間 CV分別為5.16%、5.23%。將低值樣品濃度配制到接近廠商聲明的第99百分位值(0.02 ng/mL)，其批內和批間 CV 分別為5.30%、6.07%。

表2 hs-cTnI方法批內、批間檢測不精密度

三、LoB、LoD、LoQ、LLD、BLD 結果

1.LoB 空白樣品的檢測結果呈非正態分布，故用非參數程序估計LoB，即估計第95分位數的值，LoB=[Nβ(ρ/100)+0.5]=[60 ×(95/100)+0.5]=57.5位置的結果，即第57和第58個觀察值的均數。將60個空白檢測值由小到大排序，第57和第58位置均為0.001 ng/mL，故LoB=0.001 ng/mL。見表 3。

表3 60個空白值中最高的10個值 (ng/mL)

2.LoD 系列低濃度樣品測定結果見表4。80個低濃度樣品檢測結果呈非正態分布，使用非參數程序估計 LoD，即:LoD=LoB+DS·β，式中DS·β是低濃度樣品測定中位數和第5個百分位數的間距，低濃度樣品中位數=(80×0.5+0.5)=40.5，中位數值為0.009，第5個百分位數的值 =(80× 0.05+0.5)=4.5，第 4.5 秩號的值為0.002，DS·β=0.009 － 0.002=0.007，故 LoD=LoB+DS·β=0.007+0.001=0.008 ng/mL。

3.LoQ 本實驗室依據臨床需求及權威機構規定的分析質量要求，設定化學發光免疫法檢測cTnI的總誤差目標為10%，在不考慮分析偏差的情況下，允許總誤差(TEa)=2CV，即 CV=1/2TEa。hs-cTnI在0.008 ng/mL時檢測的日間CV為9.34%，＜10%，符合質量目標要求。因此LoQ=LoD=0.008 ng/mL。見表5。

5.BLD 0.004 ng/mL實驗樣品的濃度減3s后為0.0029 ng/mL，剛高于 LLD對應的濃度0.001 ng/mL，故 PATHFAST 檢測 hs-cTnI的生物檢測限為 0.002 ～0.004 ng/mL。見表 6。

表4 系列低濃度cTnI樣品測定結果 (ng/mL)

表5 hs-cTnI低濃度樣品的日間CV

表6 hs-cTnI低濃度樣品測定結果及BLD

四、線性范圍

將平均值作為最終的測定值，與設定值做線性對比，線性方程為 Y=1.015X+0.152，R2=0.993。各測定樣品濃度見表7，線性曲線見圖2。

表7 線性范圍各濃度cTnI樣品的測定值(ng/mL)

五、生物參考區間的驗證

按NCCLS C28-A2推薦方法，驗證現用廠家提供的生物參考區間。結果顯示95%的健康個體(19名)的檢測結果落在現用參考區間內，不超過5%(1名)健康個體的檢測結果落在現用參考區間外，說明廠家提供的生物參考區間有效，適合本實驗室。各健康個體樣品濃度詳見表8。

圖2 PATHFAST檢測hs-cTnI的線性圖

表8 20名健康參考個體hs-cTnI檢測濃度值

討 論

心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是心肌損傷的特異性標志物。cTnI檢測方法的分析性能對準確檢測和評估cTnI水平及臨床診斷心肌損傷至關重要[1]。POCT平臺PATHFAST主要用于床邊快速定量檢測hs-cTnI。在使用前對儀器的主要性能進行驗證，是保證檢驗質量的一個重要措施，這也是實驗室認可的要求。因此本研究對PATHFAST檢測hs-cTnI的分析性能進行了評價。

本研究結果顯示高值樣品(2.65 ng/mL)批內CV和批間CV分別為4.70%、5.05%，中值樣品(0.65 ng/mL)批內 CV和批間 CV分別為5.16%、5.23%，低值樣品 (0.025 ng/mL)批內CV和批間CV分別為5.30%、6.07%。Francesca等[10]依據CLSI EP5-A方案檢測40個樣品得出PATHFAST檢測 hs-cTnI樣品濃度為3.1 ng/mL時的批內CV和批間CV分別為5.10%、6.0%，樣品濃度為0.66 ng/mL時的批內CV和批間CV分別為5.80%、6.30%，其兩濃度水平的批內、批間不精密度與本研究結果較為相似。而廠商提供的高值樣品(2.22 ng/mL)的批內CV和批間CV分別為2.8%、3.1%，低值樣品(0.09 ng/mL)的批內CV和批間CV分別為3.7%、3.9%。本研究結果高于廠商說明書所提供的CV值，這與本研究納入樣品例數較少有一定關系，也可能是POCT分析儀本身檢測的加樣隨機性大、試劑均一性差等導致的重復性差[11]所致。

文獻[12]報道，只有當檢測CV＜生物學變異1/2時才具有相應的臨床意義。根據文獻[8]對促甲狀腺素FS的評價，其是檢測系統或方法可定量報告分析物的具有臨床意義的最低濃度。心肌肌鈣蛋白(cTn)也引人了FS的概念，參照其他心臟標志物將CV≤10% 時濃度的最低檢測限值作為cTn的FS[13]，并采用了更符合臨床實際檢測狀況的以批間不精密度為基礎的評價FS的方法，對hs-cTnI的FS進行了評估。FS代表的是一個定量的可報告低限。這個值一般要比檢測低限高，區分從有到無的分析能力，由于其反映了實際檢測中的靈敏度，所以更有臨床價值[7]。本研究結果顯示CV=10%的最低濃度值為0.0198 ng/mL(見圖1)，與廠商說明書提供的0.02 ng/mL基本相符，與Francesca等[9]檢測系列低濃度樣品得出PATHFAST檢測 hs-cTnI的 FS為0.02 ng/mL也基本一致。蔡迪婭等[14]對 ADVIA Centaur檢測系統檢測hs-cTnI的FS進行研究得出其FS為0.042 ng/mL，結果顯示 PATHFAST檢測 hs-cTnI的FS低于ADVIA Centaur檢測系統的FS。

本研究參照 CLSI EP17-A文件確定的LoB、LoD 及 LoQ 分別為 0.001、0.008、0.008 ng/mL。參照溫冬梅等[7]用CLSI EP17-A文件建立的AFP的LoB、LoD、LoQ并對其數據作出的解釋，本研究結果顯示PATHFAST在符合質量要求的情況下能可靠地檢出hs-cTnI的最低實際濃度為0.008 ng/mL。本研究用PATHFAST檢測hs-cTnI報告時，若hs-cTnI結果低于0.001 ng/mL，則應報告“分析物未檢出，濃度 ＜0.001 ng/mL”;若 hscTnI檢測結果 ＞0.001 ng/mL 且 ＜0.008 ng/mL，則應報告“有分析物檢出，但不能準確定量，濃度＜0.008 ng/mL”;若 hs-cTnI＞0.008 ng/mL，則直接報告檢測結果。臨床醫生可放心使用濃度高于0.008 ng/mL的hs-cTnI結果。而廠商說明書只提供了一個籠統的檢測限0.02 ng/mL，對報告臨床結果不夠詳細。而 Francesca等[9]依據 CLSI EP-17A文件得出PATHFAST檢測hs-cTnI的LoB和 LoD 分別為0.0048和0.0066 ng/mL，兩者有一定的出入，這可能是在低濃度樣品濃度的選擇上不同所造成的。

本研究參照常規方法[7-8]確定的 LLD為0.001 ng/mL，BLD 為 0.002 ～ 0.004 ng/mL。國內外未見有PATHFAST的相關報道。常規方法使用光強度值(RLUs)來計算，但目前實驗室部份儀器存在局限性，即只能報告分析物的濃度，而沒有原始的分析信號。所以常規方法不適用于實驗室對所有儀器的靈敏度進行評價。本研究評估的PATHFAST無法讀出光強度值(RLUs)，參照文獻[15]用濃度直接計算得出的LLD與LoB數值一致，而BLD＜LoD。參照CLSI EP17-A文件確定的LoB、LoD和LoQ是直接使用檢測出的分析物濃度進行計算，符合實驗室的實際情況，統計分析輸入檢測數據時簡便易行。

由于廠商提供的PATHFAST檢測上限為50 ng/mL，因此本研究評估線性范圍時選取的高濃度值樣品濃度為48 ng/mL，低值為正常人樣品，按比例稀釋重復測定后做線性回歸分析得出預期濃度和實測濃度的線性方程為Y=1.015X+0.152，R2=0.993，與 Francesca 等[10]根據 EP6-A選取高值樣品(42 ng/mL)按比例稀釋得出的R2(0.995)基本一致。同時本研究按NCCLS C28-A2推薦的方法，驗證了生物參考區間。結果顯示，＞95%的檢測結果在現用參考區間以內，≤5%的檢測結果在現用參考區間以外，判定廠家提供的生物參考區間(＜0.02 ng/mL)適用于本實驗室，可以繼續使用。

本研究由于試劑成本過高，目前未對儀器的第99百分位值和樣品檢測陽性符合率進行研究，希望下一步能對第99百分位值及陽性符合率進行深入的探討。

綜上所述，參照CLSI EP系列文件及常規方法對PATHFAST檢測系統檢測cTnI分析性能進行了驗證，其可為臨床提供準確可靠的hs-cTnI結果，為心肌損傷的臨床診治提供重要信息。

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