TrkB表達變化參與神經調節素-1β對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的機制

李蜜馥 李 鵬 周景明 尹桂麗 郎達民 曹兵兵 胡煕桐 孫玉學(武警吉林省總隊醫院外三科，吉林 長春 30052)

在治療過程中，腦缺血后血流的恢復能進一步導致組織損傷和功能障礙，這種恢復血液灌注后損傷加重的情況稱為腦缺血再灌注損傷，降低再灌注損傷已成為目前治療缺血性腦血管病的關鍵〔1～3〕。研究表明神經調節素(NRGs)，尤其是NRG-1β在神經系統中表達較高，對缺血性損傷具有保護作用，但其在腦缺血再灌注損傷中的作用及其內在機制未見報道〔4，5〕。本研究旨在探討酪氨酸激酶受體 B(TrkB)表達變化在NGR-1β對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為Wistar成年大鼠60只，體重270～300 g，雌雄不限，由吉林大學基礎醫學部實驗動物中心提供。飼養期間光照12 h，黑暗12 h，水食任取。隨機分為假手術組、腦缺血再灌注模型組、NRG-1β給藥組低(0.25 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高劑量組(1 mg/kg)，共5組。NRG-1β治療組動物于缺血1 h拔除線栓后，即刻以微量注射器經頸外動脈給藥。假手術組、腦缺血模型組注射等量的生理鹽水。乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒由北京中山生物技術有限公司生產。重組人NRG-1β購自美國R＆Dsystems。冷凍切片機(山西醫療儀器器械廠);GF-D200半自動生化測定儀;倒置顯微鏡(Olympus IX71)。

1.2 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備 用20%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，做頸部正中切口，暴露右側頸總動脈并游離，向上分離頸內和頸外動脈，結扎頸外動脈。在頸外動脈下方小心分離出頸內動脈的小分支(翼突腭動脈)于分支下穿線、結扎。在分離的頸總動脈上剪一個小口。將此栓塞線由頸總動脈小口插入，向頸內動脈入顱方向推進。從頸總動脈分叉處起向內推進1.8～2.0 cm感到有輕微阻力即停止，即到達大腦前動脈，此時供應大腦中動脈的所有血供均被阻斷。扎緊頸總動脈根部的松扣，完成了大腦中動脈缺血模型的制備。1 h后，撤出栓塞線，再灌注24 h。假手術組只暴露頸總動脈及其分叉，不進行栓塞。肌肉注射青霉素8萬U以防感染。

1.3 大鼠行為障礙評分 再灌注結束后，按Longa的方法對大鼠的行為障礙進行分級評分，標準是:0分為未見神經癥狀;1分為不能完全伸展左側前爪;2分為大鼠置于光滑平面上，推手術側肩部向對側移動時阻力降低;3分為大鼠自由行走時向左側環轉、轉圈或傾倒;4分為軟癱，肢體無自由活動。積分越高，說明大鼠行為障礙越嚴重。

1.4 大鼠腦組織含水量和腦梗死體積測定 腦組織含水量測定:將大鼠斷頭完整取腦，切除前端的嗅球和后部的小腦和腦干，沿大腦正中線切開，取其左側半腦組織標本，用電子分析天平稱量濕重，然后置于紅外線干燥箱內烘干48 h至恒重，再稱干重;組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100% 。腦梗死體積測量:用大鼠切腦模具自前向后將腦組織連續切成2 mm厚的冠狀切片，共5片，置2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，避光染色10 min，置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定保存。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色，逐層拍照后，用AdobePhotoshop CS計算各層面梗死面積，乘以層面，為腦梗死體積。

1.5 大鼠血清CK和LDH含量的測定 再灌注24 h后，大鼠腹主動脈取血，離心取血清。用半自動生化分析儀按試劑盒說明書測定CK、LDH的含量。

1.6 大鼠腦組織勻漿SOD和MDA含量的測定 在冰浴中取出手術側腦組織稱重，以4℃的生理鹽水沖洗，并用4℃的生理鹽水制成10%的勻漿液，將此勻漿液4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液測定SOD和MDA的含量。

1.7 TrkB引物設計與合成 按照TRIzol試劑說明書從腦組織中提取總RNA，保存于50 μl無 RNase滅菌用水中，－80℃保存。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，應用紫外分光光度計測定RNA，A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0之間，表明RNA的純度高，可用于RT-PCPR實驗。設計引物由上海生工生物有限公司合成;TrkB上游引物:5'-TGG GAC GTT GGG AAT TTG GTT-3';下游引物:5'-CAG CCG TGG TAC TCC GTG TG-3'，特異擴增基因DNA序列，長度為347 bp;GAPDH上游引物:5'-CCC ACG GCA AGT TCA ACG G-3';下游引物:5'-CTT TCC AGA GGG GCC ATC CA-3'，特異擴增基因DNA序列，長度為409 bp。

1.8 統計學方法采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 行為障礙評分的變化 缺血再灌注模型組大鼠表現出明顯的運動功能障礙，不能完全伸展左側前爪;行走時偏向左側，部分動物手術對側肢體軟癱;與假手術組比較，模型組大鼠在缺血1 h和缺血再灌注24 h后的行為障礙明顯加重(P＜0.001)，見表1。

表1 模型組和假手術組行為障礙評分(±s)

表1 模型組和假手術組行為障礙評分(±s)

與假手術組比較:1)P＜0.001

組別 n 1 h 24 h假手術組10 0.15±0.33 0.28±0.59模型組 9 2.8±0.911) 3.7±0.871)

2.2 腦梗死體積和腦含水量變化 模型組大鼠在缺血1 h和缺血再灌注24 h后腦梗死體積明顯加重。與模型組大鼠比較，NRG-1β低劑量組、中劑量組和高級量組劑量依賴性地降低缺血再灌注大鼠的腦梗死體積(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，見表2。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠損傷腦區腦含水量明顯增加(P＜0.01)。NRG-1β中劑量組和高級量組與模型組大鼠比較腦含水量明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。低劑量組雖然降低了缺血再灌注后大鼠的腦含水量，但并沒有統計學意義(P ＞0.05)，見表2。

表2 各組腦梗死體積和腦含水量比較(±s)

表2 各組腦梗死體積和腦含水量比較(±s)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，4)P ＜0.001

組別 n 腦梗死面積(cm3) 腦含水量(%)假手術組10 0 71.75±4.98模型組 9 0.087±0.0032 87.85±5.851)NRG-1β低劑量組 9 0.065±0.002 12) 82.63±3.87 NRG-1β中劑量組 9 0.049±0.002 83) 76.11±4.982)NRG-1β高劑量組 9 0.035±0.003 94) 72.91±5.083)

2.3 血清CK和LDH含量變化 與假手術組比較，模型組大鼠在缺血再灌注24 h后血清CK和LDH明顯增高(均P＜0.001)。NRG-1β中劑量組和高劑量組與模型組大鼠比較血清CK和LDH明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。低劑量組雖然降低了缺血再灌注后大鼠的血清CK和LDH含量，但并沒有統計學意義(均P＞0.05)，見表3。

表3 各組血清CK、LDH含量(±s)

表3 各組血清CK、LDH含量(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與假手術組比較:3)P＜0.001

組別 n CK(U/L) LDH(U/L)假手術組10 518.25±71.56 183.29±38.79模型組 9 1 377.31±219.213) 617.36±79.893)NRG-1β低劑量組 9 1 299.57±131.6 518.32±49.99 NRG-1β中劑量組 9 987.33±101.251) 327.66±58.161)NRG-1β高劑量組 9 879.57±86.92) 268.45±33.782)

2.4 腦組織勻漿中SOD和MDA含量變化 與假手術組比較，模型組大鼠在缺血再灌注24 h后腦組織勻漿中SOD含量明顯降低(P＜0.001)。NRG-1β中劑量組和高劑量組與模型組大鼠比較腦組織勻漿中SOD明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。與假手術組比較，腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P＜0.01)。NRG-1β劑量依賴性降低缺血再灌注大鼠腦組織勻漿中MDA含量，與模型組比較，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)，見表4。

表4 各組腦組織勻漿中SOD和MDA含量變化(± s，U/mg)

表4 各組腦組織勻漿中SOD和MDA含量變化(± s，U/mg)

與模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與假手術組比較:3)P＜0.01，4)P ＜0.01

組別 n SOD MDA假手術組10 157.21±23.89 5.39±0.65模型組 9 88.67±15.774) 9.61±1.773)NRG-1β低劑量組 9 93.38±17.26 6.38±0.781)NRG-1β中劑量組 9 106.37±15.181) 7.02±1.121)NRG-1β高劑量組 9 132.76±13.252) 8.61±1.022)

2.5 TrkB mRNA表達情況 見圖1。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠在缺血1 h和缺血再灌注24 h后損傷腦區TrkB mRNA表達量明顯降低。與模型組大鼠比較，β型NRG-1低劑量組、中劑量組和高劑量組劑量依賴性增加缺血再灌注大鼠損傷腦區TrkB mRNA表達量。

圖1 各組腦組織TrkB mRNA表達變化

3 討論

研究表明腦缺血再灌注損傷的發病過程極為復雜，其發病機制涉及鈣超載、能量代謝紊亂、氧自由基的過度形成及損傷作用、炎性細胞因子等多個環節〔6〕。腦缺血再灌注損傷后缺血中心區的神經元死亡以壞死為主，而NRG-1β對缺血引起的神經元具有保護作用;其內在機制目前還不十分清楚，保護作用機制可能還包括對煙堿受體的調節、凋亡相關基因的調節、腦源性神經生長因子(BDNF)等神經營養因子的調節〔2，7，8〕。

NRGs是一個由四種基因編碼的多肽家族，包含四種異構體NRG-1、2、3和4。NRGs的四種同源異構體盡管功能不同，但都具有激活受體所必需的表皮生長因子(EGF)樣結構域。根據EGF樣結構域中第5，6個半胱氨酸間氨基酸的差異，可將NRG-1分為兩類:α和β型。β型NRG在神經系統中高表達，而α型表達水平則很低。NRG-1β能夠抑制缺血引起的皮質損傷和神經元凋亡而發揮其神經保護作用。NRG-1β在缺血性損傷中的作用已經得到了國內外學者的廣泛認同〔4，5，8〕。

本研究說明在缺血1 h再灌注24 h后，能夠明顯誘導大鼠腦缺血再灌注損傷，這一結果與以往研究相一致〔3〕。腦缺血、缺氧時，細胞生理功能破壞，LDH和CK釋放增加，再經受損血腦屏障進入血液循環中，血清中LDH、CK活性升高，細胞破壞越多，LDH、CK活性越強，因此LDH和CK是急性缺血性腦組織損害時的敏感指標。

本研究提示NRG-1β對腦缺血再灌注損傷潛在的治療作用。NRG-1β能提高缺血再灌注腦組織SOD活性，抑制自由基的產生并抑制氧自由基(OFR)引起的脂質過氧化反應，使MDA生成減少，從而對腦缺血再灌注損傷起保護作用，使腦組織損傷減輕。NRG-1β能減輕腦缺血再灌注大鼠神經細胞膜的損傷程度，具有神經細胞膜穩定的作用。

TrkB屬原癌基因 Trks家族成員之一，是一個由821個氨基酸殘基組成的高度糖基化分子，主要由三部分組成，即胞外區、跨膜區和胞內區。其中胞內區為酪氨酸蛋白激酶區，胞外區是一個由32個氨基酸殘基組成的信號肽。與神經系統發育過程中的關鍵信號分子腦源性神經營養因子，具有特異性高親和力。TrkB與腦源性神經營養因子結合時，受體分子二聚化，其多個氨基酸殘基快速自動磷酸化，激活細胞內信號轉導，磷酸化的轉錄因子移入細胞核并與特定基因的啟動子區結合啟動轉錄過程，而發揮生物學效應〔9〕。研究表明在缺氧、缺血、接觸神經毒物、應激等神經元損傷的情況下，Trk B能提供神經保護作用，減少損傷所導致的細胞死亡〔10〕。本研究結果提示了TrkB表達變化參與NRGS對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。但具體通過那一條信號轉導通路還需要進一步深入研究。

1 Wang L，Huang Y，Wu J，et al.Effect of Buyang Huanwu decoction on amino acid content in cerebrospinal fluid of rats during ischemic/reperfusion injury〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2013;86C:143-50.

2 Liu Z，Shen Y，Wu Y，et al.An intrinsic therapy of gold nanoparticles in focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.J Biomed Nanotechnol，2013;9(6):1017-28.

3 Chen L，Xiang Y，Kong L，et al.Hydroxysafflor yellow a protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by anti-apoptotic effect through PI3K/Akt/GSK3beta pathway in rat〔J〕.Neurochem Res，2013.

4 Li Q，Zhang R，Ge YL，et al.Effects of neuregulin on expression of MMP-9 and NSE in brain of ischemia/reperfusion rat〔J〕.J Mol Neurosci，2009;38(2):207-15

.5 Li Q，Li Z，Mei Y，et al.Neuregulin attenuated cerebral ischemia-creperfusion injury via inhibiting apoptosis and upregulating aquaporin-4〔J〕.Neurosci Lett，2008;443(3):155-9.

6 Xu M，Chen X，Gu Y，et al.Baicalin can scavenge peroxynitrite and ameliorate endogenous peroxynitrite-mediated neurotoxicity in cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.J Ethnopharmacol，2013;pii.S0378-8741(13)00574-6.

7 Kuramochi Y，Cote GM，Guo X，et al.Cardiac endothelial cells regulate reactive oxygen species-induced cardiomyocyte apoptosis through neuregulin-1beta/erbB4 signaling〔J〕.J Biol Chem，2004;279(49):51141-7.

8 Sawyer DB，Caggiano A.Neuregulin-1beta for the treatment of systolic heart failure〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011;51(4):501-5.

9 Kenny EF，Quinn SR，Doyle SL，et al.Bruton's Tyrosine Kinase mediates the synergistic signalling between TLR9 and the B cell receptor by regulating calcium and calmodulin〔J〕.PLoS One，2013;8(8):e74103.

10 Xu K，Tzvetkova-Robev D，Xu Y，et al.Insights into Eph receptor tyrosine kinase activation from crystal structures of the EphA4 ectodomain and its complex with ephrin-A5〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2013;110(36):14634-9.