GDF-5誘導成纖維細胞分化為軟骨樣細胞

王艷秋 高陽 張曼 李德華

纖維軟骨的結構特點為基質內含有90%以上的Ⅰ型膠原和少量Ⅱ型膠原，軟骨細胞較小而少，這是與透明軟骨的主要區別［1］。纖維軟骨主要位于椎間盤的纖維環和膝關節的半月板等，結構和功能非常重要，其損傷破裂和退行性變都會引起嚴重的臨床癥狀，組織工程學的修復和再生治療為此提供了新思路。

人真皮成纖維細胞(Human Dermal Fibroblasts，hDFs)是結締組織的主要細胞成分，能合成和分泌大量的Ⅰ型膠原和基質成分。致密的真皮層hDFs儲備豐富，可以通過簡單的活檢手術取材，細胞增殖能力強，自體取材不涉及倫理學問題，是構建組織工程纖維軟骨的首選種子細胞［2］。

研究表明生長分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF-5)是目前誘導成體間充質干細胞分化為軟骨細胞的最有效生長因子［3］。因此，探討應用GDF-5誘導hDFs分化為軟骨樣細胞意義重大。本實驗擬應用GDF-5誘導hDFs向軟骨樣細胞分化，并從形態、基因和蛋白表達水平進行檢測，探討hDFs作為組織工程纖維軟骨的種子細胞的可行性，為進一步構建組織工程纖維軟骨提供種子細胞相關數據。

1 材料與方法

1.1 組織來源 人真皮組織來自5例行除皺術的健康成年女性患者，年齡30～45歲，無傳染病和內分泌疾病，并簽署知情同意書，實驗經醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 L-DMEM、MTT、DMSO(Gibco);Ⅰ型膠原酶、L-脯氨酸、抗壞血酸、地塞米松、胰島素、甲苯胺藍(Sigma);GDF-5(PeproTeeh Inc);兔多抗Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體、SABC試劑盒(博士德生物試劑公司)。

1.3 hDFs的分離與培養 取成人除皺術后的皮膚組織，消毒，PBS漂洗，剪成0.5～1 mm3的小塊，Ⅰ型膠原酶室溫消化3 h，200目篩網過濾并收集消化液，1000 r/min離心5 min，棄上清液。用L-DMEM液混懸，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。每3 d換液，達90%融合時傳代培養。

1.4 hDFs的增殖活性檢測 取P3、P6、P10的hDFs，胰酶消化，以1×104/ml的細胞懸液接種于96孔板，培養24 h后，于7 d內的每24 h取出一板，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸棄培養液，每孔加 DMSO 150 μl，震蕩 10 min，用酶聯免疫儀(Bio-Rad Model 680;美國)選擇570nm波長測定各孔的光吸收值(OD值)。

1.5 檢測Ⅰ型膠原的表達 取P3的細胞行細胞爬片，達90%融合時，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-100孵育，3%H2O2室溫孵育，5%BSA封閉，兔多抗Ⅰ型膠原(1:200)，4℃孵育過夜，滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復染，光鏡觀察。結果判定:細胞胞漿內可見不同程度的棕黃色顆粒為陽性表達。

1.6 誘導hDFs分化為軟骨樣細胞 取P3的hDFs，胰酶消化，以5×105/孔的細胞懸液接種于六孔板，細胞達90%融合時更換成軟骨誘導培養液:含10%FBS的H-DMEM、100ng/ml GDF-5、10-7mol/L 地塞米松、37.5 mg/L 抗壞血酸、1 μmol/L胰島素，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每3 d換液，相差顯微鏡觀察。

1.7 檢測Ⅱ型膠原的表達 取誘導28 d的細胞爬片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2室溫孵育，5%BSA封閉后加入兔多抗Ⅱ型膠原(1:200)，4℃過夜。滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復染，光鏡下觀察。結果判定:細胞胞漿內可見不同程度的棕黃色顆粒為陽性表達。

1.8 甲苯胺藍染色檢測GAG 取誘導28 d細胞爬片，PBS漂洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min。自來水沖洗15 min，蒸餾水洗5 min，加1%甲苯胺藍2 h，95%乙醇去除多余染液。干燥后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.9 統計學方法 所有數據均用均數±標準差表示，用SPSS 13.0軟件，采用One-way ANOVA進行數據分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 hDFs的形態學觀察 原代培養的hDFs于接種24 h就有少量細胞貼壁，細胞呈梭形或紡錘形。3 d后細胞逐漸增多緊密排列。10 d左右細胞達到90%融合(圖1)。傳代細胞增殖明顯，3～5 d即達90%融合。P10以后，增殖速度仍未減慢。

圖1 原代培養10 d的hDFs(相差顯微鏡×100)

2.2 hDFs的生長曲線 MTT結果表明傳代培養的hDFs在1～2 d為潛伏期，增殖較慢;2～4 d為對數生長期，細胞增殖加快并逐漸融合;于第4 d進入生長平臺期并達峰值。P3，P6，P10的細胞生長曲線均呈“S”形(圖2)。數據分析表明3種不同代數的hDFs在相同時間的OD值沒有明顯差異(P＞0.05)，說明傳至第10代的hDFs仍能快速生長，增殖活性并未下降。

圖2 傳代hDFs的生長曲線

2.3 Ⅰ型膠原免疫細胞化學檢測結果 P3的hDFs行免疫細胞化學染色，可見大部分細胞胞核染成藍色，胞漿呈棕黃色陽性表達，表明原代培養的細胞能分泌Ⅰ型膠原，具備成纖維細胞的特性(圖3)。

圖3 hDFsⅠ型膠原免疫細胞化學染色(×100)

2.4 成軟骨誘導后細胞的形態學觀察 hDFs在GDF-5的誘導下細胞形態明顯改變，10 d時細胞由長梭形逐漸變為多角形，21 d時細胞開始變圓或卵圓形并呈聚集樣生長，形成類軟骨樣結節(圖4)。

圖4 誘導21 d的細胞(×100)

2.5 Ⅱ型膠原免疫細胞化學檢測結果 GDF-5誘導28 d的細胞行Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，可見大部分細胞核藍染，胞漿呈棕黃色陽性表達，表明GDF-5誘導后的細胞具備分泌Ⅱ型膠原的功能，符合軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原的特性(圖5)。

2.6 甲苯胺藍染色檢測GAG 經GDF-5誘導28 d細胞行甲苯胺藍染色，可見大部分細胞被染成藍色，說明誘導后的細胞可以分泌軟骨細胞外基質的主要成分GAG，具備軟骨樣細胞的特性和功能(圖6)。

圖5 Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色(×100)

圖6 甲苯胺藍染色(×100)

3 討論

種子細胞是組織工程學的第一要素，自體軟骨細胞來源及體外擴增受限，無法廣泛應用于臨床［4］。hDFs是結締組織的主要細胞成分，通過有絲分裂大量增殖，并合成和分泌大量的膠原纖維和基質成分，參與人體創口的修復工作。它合成的前膠原蛋白分子經內切酶作用，聚合和重排，可形成具有64nm周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經互相粘合形成Ⅰ型膠原纖維。hDFs可以通過簡單的活檢手術取材，并且致密的真皮層hDFs儲備豐富，分離、培養方法簡單而且細胞增殖能力強，可以自體取材不涉及倫理學問題，容易增殖［5］。因此，hDFs具有作為種子細胞的生物學特性。本實驗應用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養hDFs，細胞呈長梭形，渦輪狀緊密排列。傳代細胞生長形態均一，P10代以后的細胞仍具有很強的增殖能力。hDFs可以分泌Ⅰ型膠原蛋白，這在本實驗中也得到了證實，經免疫細胞化學染色有棕黃色的陽性表達，說明本實驗原代分離培養的細胞符合成纖維細胞的特性，屬于hDFs。

探討應用GDF-5將hDFs誘導分化為具有功能性的軟骨樣細胞是本研究的重點。GDF-5是TGF-β超家族中的一員，它可促進早期軟骨和關節形成，是目前誘導成體間充質干細胞分化為軟骨細胞的最有效生長因子［6］。因此本研究配制的軟骨誘導液是含GDF-5的高糖DMEM等混合物。本實驗GDF-5的濃度依報道［3］選用100ng/ml，其中誘導培養液中含有胰島素可促進體外培養細胞存活、有絲分裂、糖原合成;丙酮酸鈉是細胞培養中的替代碳源;BSA和脯氨酸作為細胞的營養成分，可促進細胞合成膠原;谷胺酰胺可補充必需氨基酸;維生素C是抗氧化劑，可抑制或減少細胞調亡［7］。

應用軟骨誘導液培養后，hDFs由長梭形逐漸變為類圓形，并在某些區域聚集生長，形成軟骨樣結節，表明誘導后的細胞具備了軟骨細胞的形態特征。同時對誘導后細胞進行軟骨細胞相關指標的檢測，Ⅱ型膠原是軟骨細胞分泌的特異性蛋白［8］，本研究發現誘導28 d后細胞經免疫細胞化學染色，顯示細胞胞漿呈棕黃色陽性表達，核藍染，說明經此誘導培養hDFs具備軟骨細胞分泌特異性蛋白的生物學特性。GAG是軟骨組織中含量最大的蛋白聚糖［9］，是軟骨細胞分泌的細胞外基質成分。本實驗對誘導28 d的細胞進行甲苯胺藍染色，可見大部分細胞被染成藍色，說明誘導后的細胞可以分泌GAG，具備軟骨樣細胞的特性和功能

綜上所述，本實驗從人真皮組織中成功分離培養hDFs，獲取的細胞數量多、體外增殖迅速，可分泌合成Ⅰ型膠原。在GDF-5的誘導下可分化為軟骨樣細胞，具有軟骨細胞形態，合成分泌了軟骨細胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白和細胞外基質糖胺聚糖。因此，hDFs可以作為組織工程軟骨的種子細胞。以后的研究可以應用hDFs的已軟骨分化形式和未分化形式相結合的方法，共同作為組織工程纖維軟骨的種子細胞，為成功構建組織工程纖維軟骨找到理想的種子細胞。

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