骨髓干細胞分化的成骨樣細胞與可降解鎂合金體外相容性的研究

楊曉龍 李德華 李洪秀

隨著生活節奏的加快，各種原因導致的骨組織損傷、缺損患者越來越多。目前臨床治療骨損傷的骨板、骨釘及植骨材料主要是不銹鋼、鈦合金及聚乳酸等。但這些材料不能降解需要二次手術取出，并且組織相容性差［1］。因此尋找力學性能好、組織相容性強，又可安全降解的新型骨組織工程支架材料意義重大。

最新發現表明鎂合金具有良好的力學特性及人工可降解性，有望成為新型植骨材料，應用于骨損傷的固定及組織工程骨的支架材料［2］。但鎂合金與細胞的生物相容性尚待探討，其能否利于成骨細胞的生長增殖分化尚無定論。因此，本研究擬將骨髓干細胞誘導分化為成骨樣細胞，并在體外與鎂合金材料復合培養，檢測成骨樣細胞的形態、增殖能力及成骨分化情況，為鎂合金的體外細胞相容性提供實驗數據，為其能成為新型骨修復材料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠20只，體質量100～150 g，雌雄不限，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 L-DMEM、H-DMEM、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉(Sigma)，堿性磷酸酶染色試劑盒、ALP活度檢測試劑盒(凱基生物)。

1.3 大鼠BMSCs的原代培養及向成骨樣細胞分化 大鼠行頸椎離斷法處死，無菌分離雙側股骨，含10%FBS的L-DMEM沖洗骨髓腔，接種至50 ml培養瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。每3 d換液，達80%融合時傳代培養。

取P3的BMSCs，以0.5×105/孔的細胞懸液接種于鋪有蓋玻片的六孔板。待細胞達90%融合時更換成骨誘導培養液(含10%FBS的H-DMEM、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7 mol/L地塞米松、5 mg/L抗壞血酸)。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每3 d換液。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定誘導后的成骨樣細胞 當誘導后細胞達90%融合時，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗。堿性磷酸酶染色(按試劑盒說明進行)，封片，光學顯微鏡觀察。

1.5 可降解鎂合金材料樣品的制備 將鎂合金(重量百分比:Zn 1.2%，Mn 0.6%，Ca 2.0%)支架材料用PBS清洗并吹干，置于24孔培養板，紫外線照射消毒正反面各2 h，備用。

1.6 成骨樣細胞與鎂合金材料的復合培養 消化制備2×105/ml的成骨樣細胞懸液，接種到置于24孔培養板中的鎂合金支架材料表面，孵箱內復合培養。24 h、48 h、72 h后行戊二醛固定，洗滌，脫水，CO2臨界點干燥、噴金后，掃描電子顯微鏡細胞形態。

1.7 制備鎂合金支架材料浸提液 無菌條件下，按照材料表面積/浸提介質為0.003 cm2/L的比例，加入成骨誘導培養液至盛有鎂合金支架材料的容器中。孵箱中孵育24 h后提取容器中的液體，即為浸提液，應用此浸提液進一步培養成骨樣細胞。

1.8 MTT法檢測浸提液培養的成骨樣細胞增殖活性 消化制備1×104/ml的成骨樣細胞懸液，接種至96孔板，培養24 h后，將培養液換為浸提液，對照組加入普通的成骨誘導培養液，分別培養 12 h、24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，每孔加 DMSO 150 μl，震蕩，用酶聯免疫儀選擇570nm波長測定各孔的光吸收值。

1.9 檢測浸提液培養的成骨樣細胞ALP活度 消化制備1×105/ml的成骨樣細胞懸液，接種至6孔板，培養24 h后，將培養液換為浸提液，對照組加入普通的成骨誘導培養液，分別培養12 h、24 h、48 h、72 h后，胰酶消化制成單細胞懸液，超聲粉碎細胞，按ALP活度檢測試劑盒說明書進行堿性磷酸酶活度的檢測。

1.10 統計學分析 所有數據均用均數±標準差表示，用SPSS 13.0軟件，采用One-way ANOVA進行數據分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 骨髓干細胞分化為成骨樣細胞的形態觀察及鑒定 原代培養的骨髓干細胞逐漸伸展成長梭形，類似成纖維細胞，呈渦輪狀緊密排列(圖1)。加入成骨誘導培養液后，逐漸變成多角形，具有成骨細胞的形態特點，并聚集形成鈣化結節(圖2)。堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導后的細胞含有大量ALP，呈深棕黑色陽性表達(圖3)。證實骨髓干細胞經成骨誘導后可分化為成骨樣細胞，具有成骨細胞的形態和特性。

圖1 原代培養的骨髓干細胞(相差顯微鏡×100)

圖2 骨髓干細胞誘導分化的成骨樣細胞(相差顯微鏡×100)

圖3 成骨樣細胞的堿性磷酸酶染色(光鏡×100)

2.2 掃描電鏡觀察 成骨樣細胞黏附在較粗糙的材料表面，伸展成短梭形或多角形，并伸出突起，形成細胞連接，生長狀態良好，增殖旺盛(圖4)。表明支架材料具有明顯的細胞相容性，適合細胞黏附生長。

圖4 成骨樣細胞與支架材料復合培養(掃描電鏡×100)

2.3 MTT法檢測細胞增殖活性 結果顯示隨著培養時間的延長，兩組的吸光度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導培養液均可保證成骨樣細胞正常生長，經歷了潛伏期和對數生長期。而在相同時間點兩組的吸光度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養的成骨樣細胞具有正常的增殖活性，并未受到抑制，浸提液沒有明顯的細胞毒性(圖5)。

圖5 成骨樣細胞的MTT值

2.4 ALP活度檢測 結果顯示隨著培養時間的延長，兩組的細胞的ALP活度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導培養液一樣可以促進成骨樣細胞分泌堿性磷酸酶。而在相同時間點兩組的ALP活度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養的成骨樣細胞可以維持其正常的成骨活性(圖6)。

圖6 成骨樣細胞的ALP活度值

3 討論

Friedenstein等［3］發現骨髓干細胞在一定條件下可分化為成骨細胞，表達成骨細胞表型，骨髓干細胞成功活躍在骨組織工程領域。本研究采用全血培養法分離SD大鼠股骨骨髓，培養的骨髓干細胞呈長梭形，增殖能力強，具有間充質干細胞的特性。在成骨誘導液培養下骨髓干細胞變為多角形并形成鈣結節，經堿性磷酸酶染色發現誘導后的細胞呈深棕色陽性表達，我們認為其具有成骨細胞的形態及生物學特性，可以稱為成骨樣細胞，符合成骨細胞分泌有機成分和礦物質的鑒定指標［4］。

支架材料是組織工程領域的三大要素之一，必須具備良好的組織相容性和可降解性，促進細胞的黏附和生長。作為骨組織工程的支架材料還要富于一定的韌性和硬度，因此近年來鎂合金作為可降解的新型骨組織工程支架材料備受關注［5］。其具有高分子化合物獨特的可降解性，又兼有金屬材料的堅韌性。數據表明高強度鎂合金的比強度可以達到480 gPa/(g/cm3)，密度約為1.7 g/cm3，與人的骨密度(1.75 g/cm3)較接近，符合理想的骨板要求;鎂合金的彈性模量是45 gPa，而人骨彈性模量為 20 gPa，足以滿足人植骨的要求［6］。大量研究又表明作為骨固定材料鎂合金可以加速損傷骨質愈合，抑制局部骨質疏松的發生［7，8］。

目前對于支架材料的評價包括體內和體外兩種。體外實驗是將細胞或組織與支架材料或支架浸提液復合培養，檢測細胞生長、增殖及功能等相關指標，比體內實驗更具有可控性、可重復性、可定量分析等優點［9］，是評價支架材料組織相容性的重要依據。因此本研究將誘導成功后的成骨樣細胞與鎂合金復合培養，經掃描電鏡觀察發現材料表面有大量細胞附著，生長狀態良好，表明此支架材料有利于成骨樣細胞的黏附生長。檢測浸提液培養下細胞的增殖活性，有助于考察支架材料的毒性［10］。MTT法操作簡單、靈敏度高、重復性好是檢測細胞增殖活性的主要方法。本實驗結果表明經浸提液培養的成骨樣細胞仍具有旺盛的增殖潛能，說明鎂合金支架材料不具有細胞毒性。本實驗又應用ALP活度檢測試劑盒檢測浸提液培養細胞的成骨分化情況，發現浸提液培養的細胞與正常培養液組的堿性磷酸酶活度并未出現明顯差異，說明鎂合金材料的浸提液與正常成骨誘導液一樣，也可以促進成骨樣細胞的成骨分化，具有明顯的骨誘導能力。

本實驗探討了鎂合金材料在體外促進成骨樣細胞的增殖和分化情況，但關于鎂合金植骨材料在動物體內組織中能否促進骨組織再生，有待于后續的體內實驗進行證實。

［1］Liu Zhendong，Fan Qingyu.Stress shield effect-search the lost key.Chinese Journal of Orthopaedic Trauma，2002，4(1):62.

［2］Li LC，Gao JC.Evaluation of cyto-toxicity and corrosion behavior of alkali-heat treated magnesium in simulated body fluid.Surf Coat Techn，2004，185(1):92.

［3］Shih CH，Nien J C，Shie LH，et al.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow.Stem cells，2002，20(1):249-258.

［4］Pan Feng;BAI Shu-ling.Experimental Study on the Differentiation of Cultured Bone Marrow Stromal Stem Cells(BMSCs)of Rabbit into the Osteoblast in Vitro.Progress of Anatomical Sciences，2005，11(1):12-15.

［5］Simion M，Fontana F.Autogenous and xenogeneic bone grafts for the bone regeneration.Minerva Stomatol，2004，53:191-206.

［6］Mark P Staiger， Alexis M Pietak， J erawala Huadmai，et al.Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials:a review.Biomaterial，2006，27(9):1013.

［7］Saris NE，Mervaala E，Karppanen H，et al.Magnesium:an update on physiological，clinical and analytical aspects.Clin Chim Acta，2000，294(1-2):1-26.

［8］Dai Kerong.Fracture fixation and stress shield effect.Journal of Medical Biomechanics，2001，15(2):69.

［9］Witte F，Kaese V，Haferkamp H，et al.In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response.Biomaterials，2005，26(17):3557-3563.

［10］Sun J，Li J，Liu X，et al.Proliferation and gene expression of osteoblasts cultured in DMEM containing the ionic products of dicalcium silicate coating.Biomed Pharmacother，2009，63(9):650-657.