馬尾松花粉醇提物降脂作用與預防肥胖的實驗研究

宋 航，張 含，劉 銘，許繼敏，耿 越

山東省動物抗性生物學重點實驗室生命科學學院山東師范大學，濟南 250014

肥胖是由于食物攝入過多或機體代謝改變而導致體內脂肪積聚過多造成體重的過度增長，并引發機體生理病理性改變。現代人常見的飲食無序、長久靜坐、缺乏運動等生活方式會導致體內脂肪代謝率下降，積累過多會形成肥胖，進而容易可引發心臟病、糖尿病、動脈粥樣硬化、脂肪肝等多種疾病。所以尋找合適的方法促進體內脂質代謝對于預防肥胖相關疾病的發生具有重要意義。

松花粉入藥為松黃，在我國多部醫書中曾有“久服輕身益氣力”、“久服令輕身”等記載，藥用和食用歷史悠久。近年來，國內外對松花粉有益成分、藥理作用和生理功能進行了大量的相關研究。據相關實驗分析，馬尾松花粉含有18種人體必需的氨基酸和10多種維生素以及核酸、酶類、黃酮類、礦物質、不飽和脂肪酸、膳食纖維等有益降血脂的物質。有研究發現破壁松花粉在降低體脂質水平和增加脂質排泄方面具有良好的效果。

本實驗以破壁馬尾松花粉為原料，進一步探討松花粉中醇提物組分對機體脂質代謝的調控及預防肥胖的初步機制。

1 材料與方法

1.1 破壁馬尾松花粉

破壁馬尾松(Pinus massoniana)花粉由煙臺新時代健康產業集團提供，破壁率大于95%。破壁方法采用低溫氣流粉碎法［1］。

1.2 動物分組及飼養方法

選取100只4周齡昆明白雄性小鼠，實驗開始前適應性喂養一周，篩選出初體重為(19±1)g的小鼠60只，隨機分為6組:松花粉醇提物低劑量(EEL，0.0625 g/kg bw·d)、中劑量(EEM，0.125 g/kg bw·d)和高劑量(EEH，0.25g/kg bw·d)三個組;奧利司他陽性對照組(PC，0.05g/kg bw·d);空白對照組(NC)和高脂飼糧組(FC)。

小鼠飼養環境及操作:每籠5只;環境溫度(22±2)℃，濕度30% ～70%;日光燈照明12 h交替;自由進食，NC組喂養基礎飼糧，其余各組喂養高脂飼糧;每日下午3～4點進行灌胃操作，醇提物和奧利司他都溶于大豆油中，3個醇提物實驗組和陽性對照組小鼠分別灌胃約0.3 mL;每3 d記錄體重;飼養6周后，禁食12 h;眼球摘除取血，之后引頸處死;解剖小鼠取腎臟周圍以及睪丸周圍的脂肪，取小鼠肝臟，均迅速置于-80℃冰箱中保存待測。

小鼠血液取出后于室溫靜置2 h后置于(4～8)℃冰箱中靜置過夜，10000 rpm離心10 min，取上清待測。

1.3 實驗材料及儀器設備

1.3.1 基礎飼糧

動物實驗室普通小鼠飼糧。

1.3.2 高脂飼糧

組成為75%基礎飼糧，15%豬油，10%伊利全脂奶粉。

1.3.3 馬尾松花粉醇提物由本實驗室制備

3.5kg的破壁馬尾松花粉，乙醇三次浸提，料液比分別為:1∶10、1∶5 和 1∶5。超聲 2 h，頻率 26.4 kHz、提取溫度50℃，攪拌轉速:27 rpm。合并三次所得提取液，靜置，取澄清液體。旋蒸濃縮，溫度45℃，真空度0.1 MPa，直到沒有乙醇味道為止。得到497 g浸膏，得率為14.2%(1g醇提物相當于7.04 g馬尾松花粉)。

1.3.4 陽性對照物

奧利司他(orlistat，濟南偉都化工有限公司)，HPLC純度98.2%，溶于大豆油中。

1.3.5 試劑盒

總膽固醇(TC，CHO酶法)、甘油三酯(TG，酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC，選擇性沉淀法)試劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑有限公司;脂肪因子(瘦素LEP、脂聯素ADP、抵抗素Resistin)試劑盒為上海雅吉生物科技有限公司小鼠Elisa試劑盒;肉堿棕櫚酰轉移酶I(CPT-I)(天潤生物科技有限公司代測);蛋白質定量(南京建成生物科技有限公司BCA蛋白定量法)。

1.3.6 儀器設備

GDC-TQ/ZS/4中試型多功能超聲波提取及濃縮設備(濟南金百特工程機械有限公司);GQ105高速管式分離機(上海浦東天本離心機械有限公司);SB1000旋轉蒸發儀(EYELA);BS 124 S電子天平(Sartorius);5804 R低溫離心機(Eppendorf);Stat Fax-2100酶標儀(AWARENESS);RT-1904C生化分析儀。

1.4 測定指標

測定指標包括:終體重(final weight);體重凈增加(weight net increase)=實驗終體重－實驗初體重;體重增長率(weight gain rate)=體重增量/實驗初體重×100%;體脂總重(fat content)=腎臟周圍脂肪重+睪丸周圍脂肪重;體脂比(rate of body fat)=體脂總重/實驗末體重×100%;小鼠血清中脂質(TC、TG、HDLC)含量;小鼠血清中脂肪因子(LEP、ADP、Resistin)水平;肝臟及白色脂肪組織中肉堿棕櫚酰轉移酶I(CPT-I)含量。

1.5 統計方法

計算各組參數的平均值和標準偏差，采用SPSS19.0進行數據分析。

2 實驗結果

2.1 小鼠體重和體脂變化

實驗結束時FC組平均終體重高達51.64 g，凈增重20.50 g，體重增長率高達59.29%，與NC組相比有極顯著性差異(P ＜0.01)，證明肥胖模型建模成功。從表1可見，EEL、EEM和EEH組的終體重與FC組相比都有明顯降低，差異極顯著(P ＜0.01)，同時在體重凈增加和體重增加率方面也都有明顯降低(P＜0.01);3個實驗組的體脂含量與FC組相比都有不同程度的降低，體脂比與FC組相比略有 升高，但無顯著差異。

表1 小鼠體重和體脂變化(n=5)Table 1 Body weight and fat change of mice(n=5)

2.2 小鼠血清脂質水平變化

從表2可見，EEL組(143.47 mg/dl)和EEH組(125.55 mg/dl)與FC 組(173.97 mg/dl)相比TC 含量都明顯降低，并且EEH組有極顯著性差異(P＜0.01);三個實驗組的TG含量與FC組相比都有明顯降低，差異極顯著(P＜0.01);HDLC含量與FC組相比也都有極顯著升高(P＜0.01)。

表2 小鼠血清脂質水平變化(n=5)Table 2 Differences of lipid profile in mice serum(n=5)

2.3 小鼠血清脂肪因子水平變化

從表3可見，三個實驗組可以升高LEP水平，與FC組相比差異不顯著;ADP的含量與FC組相比都有不同程度升高，其中EEM組(89.04 ng/mL)有明顯升高，差異極顯著(P＜0.01);Resistin含量與FC組相比都有極顯著升高(P＜0.01)。

表3 小鼠血清脂肪因子水平變化(n=5)Table 3 Adipokines change in mice serum(n=5)

2.4 肝臟和脂肪CPT-Ⅰ含量變化

從表4可見，三個實驗組的肝臟和脂肪CPT-I含量與FC組相比都有明顯升高，差異都具有極顯著性(P ＜0.01)。

表4 肝臟和脂肪CPT-I含量變化(n=5)Table 4 CPT-I changes in mice liver and adipose tissue(n=5)

3 討論

實驗結果說明馬尾松花粉醇提物在體重調節方面具有良好效果，3個醇提物實驗組無論是體重增長值還是增加率與FC組相比都有顯著降低;體內脂肪的堆積與FC組相比較也有明顯減少。但體脂比略有升高，推測的原因可能是，本實驗僅僅分離了腎臟和睪丸周圍的脂肪組織，沒有考慮其他臟器及皮下脂肪的堆積，從而導致比值上升。

膽固醇是人體及動物組織細胞所不可缺少的重要物質，甘油三酯是人體內含量最多的脂類，當體內膽固醇和甘油三酯積累過多時，容易形成動脈粥樣硬化。實驗結束時3個醇提物實驗組小鼠血清中TC和TG的水平相比FC組均得到明顯抑制。根據樊柏林等［4］研究證實，破壁松花粉能夠通過降低血脂起到預防和控制大鼠實驗性高脂血癥形成的作用。同時趙霖等［3］證實，破壁松花粉可通過增加排脂起到調節機體脂代謝的作用。但與本實驗不同的是這些研究采用的是破壁后松花粉的全營養成分，并沒有進一步分離組分。在劉杰爾等［5］研究中采用油松松花粉醇提物，在TC和TG指標上結果趨勢與本研究基本一致。有研究證實馬尾松花粉脂肪酸成分中含有較高濃度的不飽和脂肪酸［6］，而不飽和脂肪酸是氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)的天然激動劑［7，8］。PPARs在體內起到提高胰島素敏感性、調控脂肪酸代謝水平和降低體內脂質水平的作用［9］。本實驗結果證實了松花粉醇提物能夠促進膽固醇轉運，降低甘油三酯水平。推測除去花粉壁所含的膳食纖維類物質，馬尾松花粉確實含有能調節血脂代謝的成分，對于促進機體脂質代謝、預防肥胖發生，均具有重要意義。

實驗中小鼠在灌胃松花粉后血清中HDLC水平也得到顯著性提升。高密度脂蛋白(HDL)由肝臟合成，然后在卵磷脂膽固醇脂酰基轉移酶(LCAT)的作用下催化HDL與游離膽固醇結合成HDLC，起輸出膽固醇、促進膽固醇代謝的作用，其在體內含量的高低與動脈粥硬化的形成有關［2，3］。據醫書記載松花粉具有保護肝臟的功效，能夠促進肝細胞活性和解毒功能，這一點從肝臟中CPT-I酶含量得到升高可以看出，可能與松花粉含有多種維生素和礦物質有關，維生素和礦物質可以作為體內多種酶的輔酶或輔助因子促使酶行使催化功能。所以松花粉可以促進肝細胞活性，提高包括合成高密度脂蛋白在內的脂質代謝相關的酶活水平，具體調控機制需要進行相關合成酶的酶活水平的檢測來進一步說明。

ADP由胰島β細胞分泌促進血液中的葡萄糖進入肌肉或脂肪組織氧化代謝，有研究證實ADP可增強骨骼肌中脂肪酸的氧化，抑制血漿游離脂肪酸的升高，還具有抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用;LEP是由脂肪組織分泌的參與調節糖、脂肪及能量代謝的一種肽類激素，能夠減少機體攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞合成。LEP受體基因突變可導致肥胖并引發糖尿病。3個醇提物實驗組小鼠體內脂聯素水平相比FC組均得到明顯提升，LEP水平也有不同程度升高。從體重體脂檢測結果來看，有效提升ADP和LEP水平能有效抑制肥胖形成。實驗中抵抗素(Resistin)水平相比FC組也有明顯提升，Steppan等［10］證實，Resistin能夠促使形成胰島素抵抗，引起高血糖癥。所以提升體內Resistin的水平并不利于促進脂質代謝，對于松花粉醇提物在脂肪因子水平上的具體調控機制還有待進一步研究。

CPT-I是脂肪酸β氧化最重要的限速酶，促使脂肪酸轉運至線粒體基質進行β氧化。醇提物實驗組小鼠體內肝臟和脂肪的CPT-I含量相比FC組都有明顯提升，甚至超過了NC組。CPT-I含量的提升對于體內脂質氧化代謝起到促進作用，從而達到減少體內脂質蓄積，進而減輕體重。

實驗通過多個角度探討了馬尾松松花粉醇提物在體重調節和脂代謝調控方面的作用。結果說明松花粉醇提物在促進脂質代謝，減少脂質積累方面效果顯著，可有效預防肥胖形成。為臨床減肥藥物的研制提供了很好的實驗依據。

1 Chen Y(陳英)，Liu ZH(劉志河)，Yang FL(楊風樓)，et al.Pine pollen cold airflow smashing method.CN01115014.9.2002-08-28.

2 Sun P(孫屏)，Fan LM(范樂明).Related gene expression product of high density lipoprotein metabolism.Chin J Arter(中國動脈硬化雜志)，2006，14:543-546.

3 Zhao L(趙霖).Study of masson pine pollen on lipid metabolism in the piglet model.Acade J PLA Postgrad Med School(軍醫進修學院學報)，2007，27:445-447.

4 Fan BL(樊柏林)，Wang HM(王護民)，Song Y(宋毅)，et al.Study on the effect and functional mechanism of pine pollen on reducing the blood-fat level of the experimental mice.Occup Health(職業與健康)，2008，22:2012-2014.

5 Liu JE(劉杰爾).Studies on components of pine pollen and its weight control effects in vitro and in vivo.Hangzhou:Zhejiang University(浙江大學)，MSc.2008.

6 Liu H(劉輝).Determination of fatty acids in sporodermbroken pollen of Pinus massoniana by GC-MS.Chin Wild Plant Res(中國野生植物資源)，2006，25(5):57-58.

7 Kliewer SA，Sundseth SS，Jones SA，et al.Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors α and γ.Proceed National Acade Sci，1997，94:4318-4323.

8 Forman BM，Chen J，Evans RM.Hypolipidemic drugs，polyunsaturated fatty acids，and eicosanoids are ligands for peroxisome proliferator-activated receptors α and δ.Proceed National Acade Sci，1997，94:4312-4317.

9 Luquet S，Gaudel C，Holst D，et al.Roles of PPAR delta in lipid absorption and metabolism:a new target for the treatment of type 2 diabetes.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease，2005，1740:313-317.

10 Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin links obesity to diabetes.Nature，2001，409:307-312.