竹節參總皂苷抑制急性低壓缺氧大鼠腦和心肌損傷的形態學觀察

周湘潔，牛東濱，郭志剛，王 亮，趙 琦，杜學禮，竇躍龍

1中國人民解放軍總裝備部后勤部航天城門診部;2中國航天員科研訓練中心，北京，100094;3清華大學化工系，北京 100084

竹節參(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人參屬植物，具有滋補強壯、活血化瘀、消腫止痛、健胃、祛痰、解熱的功效，主治跌打損傷，筋骨疼痛，風濕痹癥，是我國的一種名貴中草藥。現代藥理學研究表明，竹節參具有抗潰瘍、保肝、鎮靜、鎮驚、抗疲勞、損傷保護、免疫、鎮痛、抗炎、抗腫瘤等多種活性［1］。有學者的研究表明，竹節參提取物能夠抑制血栓的形成［2］，對完全性和不完全性腦缺血、胃缺血、心肌缺血以及再灌注損傷動物模型具有保護作用［3-6］;竹節參皂苷能夠抑制腦及心肌缺血缺氧的損傷，減輕組織水腫，可能與其改善機體自由基代謝、干預缺血后的細胞凋亡等有關［7-10］。但有關竹節參總皂苷在抗低壓缺氧方面的研究尚未見報道。

在載人航天在軌飛行中，當航天員出艙活動往返于軌道艙和氣閘艙之間時，面臨的風險之一就是急性低壓缺氧，高原作業以及疾病發生過程中也會經常發生缺氧狀況。本實驗擬將大鼠暴露于模擬海拔8000 m低壓缺氧艙內8 h，建立動物急性低壓缺氧模型，以紅景天提取物為中藥陽性對照，尼莫地平為西藥陽性對照，竹節參總皂苷為實驗對象，通過光鏡對實驗動物的心腦組織細胞變化進行形態學觀察，以研究急性低壓缺氧對機體產生的損傷和藥物的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物選用Wistar大鼠，雄性，4月齡，體重195～212 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗動物合格證號SCXK(京)2006-0009。竹節參總皂苷，由清華大學化工系生化所利用索式提取以及制備色譜法從竹節參培養細胞中提取分離獲得。尼莫地平注射液:4 mg∶20 mL，(批號:0503101，山東亞寶藥業股份有限公司生產);紅景天提取物(由“八一”體工隊藥物研究所提供)。動物加壓減壓實驗艙:蕪湖潛水設備廠生產。

1.2 動物分組設計

選取Wistar大鼠60只，隨機分為5組，每組12只。即①竹節參總皂苷組，②紅景天提取物組，③尼莫地平組，④陰性對照組(低壓處理對照組)，⑤空白對照組(常壓處理對照組)。

1.3 給藥方法

竹節參總皂苷與紅景天提取物分別制成溶液。實驗動物采用分籠飼養，每籠6只，自由采食。適應飼養4 d后，①、②、③組每日清晨灌胃給藥，劑量為:①組為相當于竹節參總皂苷100 mg/kg，②組為相當于紅景天提取物量100 mg/kg，③組為相當于尼莫地平1 mg/kg，④、⑤組灌胃給與等量生理鹽水。動物連續灌胃給藥14 d。

1.4 大鼠急性低壓缺氧模型的制備方法

實驗動物分組灌胃給藥14 d后，于末次給藥30 min后開始進行急性低壓缺氧實驗，將動物置于動物加壓減壓實驗艙內(艙容積為1 m3)，關閉艙門，調整艙內壓力漸減，在10 min左右將艙內壓力減至0.068 MPa(相當于以10 m/s上升至海拔8000 m)，維持此壓力8 h，制備大鼠急性低壓缺氧模型，艙內溫度保持為恒溫16℃，完成缺氧時間后將艙內壓力升至正常大氣壓，速度仍為10 m/s;空白對照組置于實驗艙附近，于正常大氣壓下滯留8 h。動物出艙后30 s內迅速斷頭、取血、分離腦組織，進行觀察、保存和檢測。

1.5 組織切片樣本處理

每組隨機取3只大鼠，切除右側半腦，置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用小塊紗布包裹，鉛筆標記，置于10%的福爾馬林溶液中，同樣方法取心肌組織并保存。

1.6 腦組織含水量測定

大鼠斷頭取腦后，用濾紙吸去腦表面的水分，每組取9只大鼠的右側半腦，分析天平稱濕重(w)，用鋁箔紙分別包裹標記，置110℃烘箱內烘干24 h至恒重(D)，用干濕重法(H2O)%=〔(W-D)/W ×100%〕計算每份腦組織水含量，結果用%表示。并用鄧肯氏測驗法對不同處理的數據進行了差異顯著性分析。

1.7 細胞形態學的觀察

將心肌、腦組織分別置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用 10% 福爾馬林固定。通過脫水、透明處理、浸蠟、包埋、切片、用蘇木素染色液染色、水洗、伊紅復染、脫水透明和樹脂封固等步驟，再置于光學顯微鏡下觀察心、腦組織細胞形態變化。

2 結果與討論

2.1 竹節參總皂苷對Wistar大鼠腦組織含水量的影響

實驗結果如表1所示，與空白對照組相比，各低壓缺氧模型組Wistar大鼠的腦組織含水量均顯著升高。其中竹節參總皂苷組、紅景天提取物組和尼莫地平組等三個給藥組的腦組織含水量沒有顯著性差異，但是均顯著低于陰性對照組。表明竹節參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥的Wistar大鼠，在低壓缺氧環境下均具有抑制腦組織水腫的作用。因此可以證明竹節參總皂苷具有與紅景天提取物相同的抗腦組織水腫的效果，該結果與劉家蘭［4］等的實驗結論基本相同。至于竹節參總皂苷抑制腦組織水腫的作用機理，可能與竹節參總皂苷具有抗氧化、抑制氧自由基生成［6，8］，抑制了細胞膜脂質過氧化，改善了細胞膜的鈣離子釋放等作用相關。具體作用機制還有待于進一步研究。

表1 竹節參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠腦組織含水量的影響Table 1 Effect of PJTS on brain tissue water content of rat in acute hypobaric hypoxia

2.2 竹節參總皂苷對急性低壓缺氧Wistar大鼠腦組織和細胞損傷的抑制效果

從腦組織外觀和顯微觀察(圖1)發現，空白對照組Wistar大鼠的腦組織形態顯示腦膜血管無擴張，腦組織無腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結構及層次明顯，形態結構清晰完整，腦實質中細胞核仁清晰，神經纖維細胞縱橫交錯，排列致密(圖1a)。而陰性對照組的形態顯示，腦膜血管中度擴張，腦組織細胞極度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結構及層次紊亂，細胞水腫明顯，胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質疏松水腫(圖1b)。竹節參總皂苷給藥組的形態顯示腦膜血管輕度擴張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結構及層次較陰性對照組清楚，腦組織結構變化不大，細胞水腫不明顯，胞漿減少，極性存在，間質輕微疏松，有少量細胞出現腫脹，胞漿有空泡化現象(圖1c)。紅景天提取物給藥組的形態顯示腦膜血管輕度擴張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，細胞有輕度水腫，細胞腫脹，間質疏松(圖1d)。尼莫地平給藥組的形態顯示腦膜血管中度擴張，腦組織中度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結構及層次較陰性對照組清楚，細胞水腫較明顯，部分細胞變形，胞漿減少，胞漿空泡化，間質疏松(圖1e)。實驗結果表明，在急性低壓缺氧環境下，Wistar大鼠的腦組織和細胞會受到極大損傷。竹節參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環境下，其腦細胞同樣受到傷害，但是與陰性對照組相比其損傷癥狀明顯減輕。特別是竹節參總皂苷給藥組的腦細胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節參總皂苷在急性低壓缺氧環境下可以保護Wistar大鼠腦細胞的結構和功能的完整性。

圖1 竹節參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠腦組織和細胞形狀的影響(光鏡HE染色，×400)Fig.1 Effect of PJTS on brain tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，×400)

2.3 竹節參總皂苷對急性低壓缺氧Wistar大鼠心肌組織和細胞損傷的抑制效果

從心肌組織外觀和顯微觀察(圖2)發現，空白對照組的形態顯示Wistar大鼠的心肌組織無腫脹，無異常變化;組織切片顯示，心肌各部位結構及層次清楚，形態結構清晰完整，心肌纖維細胞縱橫交錯，排列有致(圖2a)。而陰性對照組的形態顯示心肌膜血管中度擴張，組織腫脹;組織切片顯示心肌各部位結構及層次紊亂，細胞水腫明顯，細胞變形、胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質疏松水腫(圖2b)。竹節參總皂苷給藥組的形態顯示心肌膜血管輕度擴張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細胞輕度水腫，心肌組織結構變化不大，有少量細胞腫脹，間質輕微疏松，胞漿有空泡化現象(圖2c)。紅景天提取物給藥組的形態顯示心肌膜血管輕度擴張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細胞有輕度水腫，腫脹，胞漿減少，極性存在，間質輕微疏松(圖2d)。尼莫地平給藥組的外觀顯示大鼠心肌膜血管輕度擴張，組織腫脹;組織切片顯示細胞水腫較明顯，細胞腫脹，部分細胞胞漿變寬，排列紊亂(圖2e)。實驗結果表明，在急性低壓缺氧環境下，Wistar大鼠的心肌組織和細胞會受到極大損傷。竹節參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環境下，其心肌細胞同樣受到一定傷害，但是與陰性對照組相比其損傷程度明顯減輕。特別是竹節參總皂苷給藥的心肌細胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節參總皂苷在急性低壓缺氧環境下，可以有效保護Wistar大鼠的心肌組織和細胞的結構以及功能的完整性。

總之，從組織和細胞的形態變化可以明顯看到竹節參總皂苷在急性低壓缺氧環境下，對于Wistar大鼠的腦和心肌細胞均具有良好的保護作用。至于其作用機理可能與竹節參總皂苷具有抗氧化、清除氧自由基，維護細胞膜通透性，抑制腦和心肌缺血損傷密切相關［3-10］，但是由于竹節參總皂苷中含有竹節參皂苷、人參皂苷和三七皂苷等，其保護效果不是某單一物質在起作用，而是多種皂苷類化合物綜合作用的結果。如果要徹底解析其作用機制，還需要進一步深入探討。

圖2 竹節參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠心肌組織細胞形態的影響(光鏡HE染色×400)Fig.2 Effect of PJTS on myocardial tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，× 400)

1 Ouyang LN(歐陽麗娜)，Xiang DW(向大位)，Wu X(吳雪)，et al.竹節參化學成分及藥理活性研究進展.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:1023.

2 Matsuda H，Samukawa K，Fukuda S.Studies of Panax japonicas fibrinolysis.Plant Med，1989，55:18.

3 Liu JL(劉家蘭)，Li DQ(李德清)，Liu H(劉紅).Protcvtive effect of Panax japonicus C.A.meyer extractive on myocardial ischemic damage in mice.J Hubei Univ Nationalities，Med(湖北民族學院學報，醫學版)，1999，16:6.

4 Liu JL(劉家蘭)，Li DQ(李德清)，Duan XY(段先宇).Protection of Panax japonicus extract against mice and rats cerebral ischemia reperfusion injury.J Hubei Univ Nationalities，Med(湖北民族學院學報，醫學版)，2002，19:35.

5 Liu H(劉紅).Protective effect of Panax japonicus extracts experimental cerebral ischemia.J Hubei Univ Nationalities，Med(湖北民族學院學報，醫學版)，2000，17:12.

6 Liu H(劉紅).Effect of Panax japonicus in protecting gastric Ischemia-reperfusion injury.J Hubei Univ Nationalities，Med(湖北民族學院學報，醫學版)，2002，19(2):1.

7 Min J(閔靜)，Ao MZ(敖敏章).Effect of total saponins of Panax japonicus on immunological function.Lishizhen Medicine and Materia Medica Res(時珍國醫國藥)，2007，18:2784.

8 Min J(閔靜)，Ao MZ(敖敏章)，Hu J(胡菁)，et al.Experimental research on anti-oxidation effect of total saponins of Panax japonicus.J Hubei Voca-Tech Col(湖北職業技術學院學報)，2007，10:110.

9 Jia ZH(賈占紅)，Zhao H(趙暉).Effects of TSPJ on neuronal apoptosis and related gene expression in rat cerebral ischemia-reperfusion injury.Chin J Exp Traditl Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2011，17:168.

10 Zhao H(趙暉)，Li J(李佳)，Liu NC(劉南岑)，et al.Effects of total rhizoma Panacis japonica saponins on injury and antioxidase activities in rats brain with focal cerebral ischemia.Chin J New Drugs Clin Rem(中藥新藥與臨床藥理)，2007，18:445.