蒼白桿菌產生脂肽的結構解析

程斌斌，楊世忠，牟伯中

(華東理工大學化學系，上海 200237)

生物表面活性劑是一類由微生物代謝產生的表面活性物質，其結構同時具有親水性和疏水性，具有很高的表面活性和生物活性［1］。生物表面活性劑不僅具有優良的表界面活性、化學穩定性和熱穩定性，還具有抗菌、抗病毒、環境友好可降解等特性。生物表面活性劑已經在3次采油(MEOR)、化妝品和環境修復領域開始應用，同時在食物、醫藥領域具有廣闊的應用前景。脂肽是一種重要的生物表面活性劑，主要來源于芽胞桿菌、假單胞菌、曲霉菌、鏈霉菌、沙雷氏菌屬和游動放線菌的菌屬等。表面活性素(Surfactin)是一類典型的脂肽表面活性劑，其結構是由β-羥基脂肪酸和7個氨基酸組成的環狀脂肽組成。脂肽在酸性條件下高溫密封水解成游離的β-羥基脂肪酸和氨基酸后，甲酯化后通過氣質聯用(GC-MS)分析脂肪酸組成［2］;硅烷化后通過GC-MS分析氨基酸組成［3］。近年來，串聯質譜技術(MS/MS)的發展，為分析脂肽中氨基酸以及氨基酸的連接順序帶來了極大的便利［4］。本文從油藏產出液中分離出1株能代謝產生脂肽的細菌，通過16S rDNA的方法鑒定為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)。這是首次發現蒼白桿菌也能夠代謝產生脂肽。通過GC-MS分析了脂肽中脂肪酸和氨基酸的組成，并結合MS/MS進一步分析了肽環氨基酸的連接順序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 KH2PO43.0 g，Na2HPO4·12H2O 25.2 g，NH4NO32.0 g，MgSO40.1 g，CaCl220 μmol/L，MnSO430 μmol/L，蔗糖 20.0 g，酵母粉0.5 g，加去離子水配成1 L溶液。

1.1.2 主要儀器和試劑 主要儀器:氣質聯用儀6890GC-7895MS(Agilent，USA)，四級桿-飛行時間串聯質譜(Q-Tof Micro，UK);主要試劑:N，O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)(Sigma-Aldrich，USA)、甲醇、硫酸、鹽酸、無水乙醚等試劑均為國產且純度為AR。

1.2 方法

1.2.1 富集培養 細菌接種于含有液體培養基的三角瓶中，空氣搖床37℃恒溫培養，轉速150 r/min發酵培養。

1.2.2 生物表面活性劑的提取 發酵液經5 000 r/min離心30 min，移取上層清液。上清液中滴加6.0 mol/L鹽酸，調節 pH≤2.0，4 ℃冰箱中放置過夜。再次離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，烘干得到生物表面活性劑粗品。加入無水乙醚充分震蕩萃取3次，收集上層乙醚相，除去乙醚后冷凍干燥獲得脂肽浸提物。

1.2.3 脂肽的水解 取10 mg脂肽放入安瓿瓶中，加入6.0 mol/L鹽酸1.0 mL，用酒精噴燈熔燒瓶口密封，密封后90 ℃水解24 h［2］。

1.2.4 脂肪酸分析 水解結束后將反應液移至試管中，并加入5倍體積的去離子水。加入1.0 mL無水乙醚萃取3次，收集萃取乙醚相。在除去乙醚的干燥樣品中加入1.0 mL的10%(體積比)硫酸-甲醇溶液，55℃反應6 h，反應結束并冷卻后，加入5倍體積去離子水稀釋，加入0.5 mL無水乙醚萃取3次，收集乙醚相。吹干乙醚，加入0.5 mL甲醇超聲溶解，然后移入GC-MS進樣瓶中，用GC-MS分析。實驗所用的氣相色譜-質譜聯用儀是美國安捷倫公司的6890GC-5975MS型儀器，配有HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm，5%苯基甲基硅氧烷填充)。氣相色譜條件:載氣為高純度氦氣(99.999%)，進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，分流比 10∶1，進樣量1.0 mL;程序升溫條件:起始溫度120℃(維持3 min)，升溫速率10℃/min升溫至260℃，維持5 min;質譜條件:EI離子源，離子源溫度230℃，電離電壓70 eV，四級桿溫度150℃。

1.2.5 氨基酸分析 水解結束后將反應液移入GC-MS進樣瓶中，吹干，105℃烘干2 h，加入0.30 mL乙腈，混勻后再加入0.20 mL的 N，O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)試劑，密封后60℃恒溫硅烷化反應20 min。反應結束后，混勻樣品直接用GC-MS測定氨基酸的組分。實驗所用的氣相色譜-質譜聯用儀同1.2.4。氣相色譜條件:載氣為高純度氦氣(99.999%)，進樣口溫度250℃，流速1.0 mL/min，分流比 10∶1，進樣量 1.0 mL;程序升溫條件:起始溫度60℃(維持3 min)，升溫速率10℃/min升溫至250℃，維持5 min;質譜條件:EI離子源，離子源溫度230℃，電離電壓70 eV，四級桿溫度150℃。

1.2.6 串聯質譜分析 串聯質譜分析條件:離子源溫度80℃;解離溫度150℃;毛細管電壓，進樣錐電壓，離子能量及碰撞能量分別為3 kV、40 V、1.5 V及60 V。鈉離子化的目標分子由第一級四極桿質譜質量分析器選取，并經惰性原子轟擊而碎裂成片斷，產生的鈉離子化的碎片再經第二級飛行時間質譜質量分析器分析并記錄下MS/MS。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸組成

脂肽經過鹽酸高溫水解之后產生游離β-羥基脂肪酸，酸性條件下與甲醇反應得到β-羥基脂肪酸甲酯，然后通過GC-MS方法檢測，檢測總離子色譜圖見圖1。

β-羥基脂肪酸甲酯發生極性基團的α-碎裂，產生質荷比 m/z=103的［CH(OH)CH2COOCH3］+離子碎片，由此，提取質荷比為m/z=103的離子色譜見圖2。圖2中有8個色譜峰，保留時間分別為 10.3、10.4、11.4、11.8、12.5、12.6、13.5 和 13.8 min。在質譜中 β-羥基脂肪酸甲酯高質量端離子峰丟失H原子、H2O、(CH3OH+H2O)產生M-1、M-18和M-50的碎片離子峰。由此可以判斷這8個脂肪酸甲酯分子量分別為244、244、258、258、272、272、286 和286，即2 個 C13β-羥基脂肪酸甲酯、2個C14β-羥基脂肪酸甲酯、2個C15β-羥基脂肪酸甲酯和2個 C16β-羥基脂肪酸甲酯。具有相同碳鏈長度的β-羥基脂肪酸甲酯由于支鏈的差異具有n、iso或者anteiso的結構。文獻也報道了8種具有不同結構的β-羥基脂肪酸的脂肽，分別為iso C13β-羥基脂肪酸、anteiso C13β-羥基脂肪酸、iso C14β-羥基脂肪酸、n C14β-羥基脂肪酸、iso C15β-羥基脂肪酸、anteiso C15β-羥基脂肪酸、iso C16β-羥基脂肪酸和n C16β-羥基脂肪酸［5-8］。Hosono 等［9］發現 β-羥基脂肪酸甲酯的保留時間與其碳原子數之間存在線性關系，并且具有相同碳原子數目的β-羥基脂肪酸甲酯的保留時間具有以下關系:iso＜anteiso＜n。據此分析，脂肽樣品的脂肪酸鏈分別iso C13 β-羥基脂肪酸、anteiso C13β-羥基脂肪酸、iso C14β-羥基脂肪酸、n C14β-羥基脂肪酸、iso C15β-羥基脂肪酸、anteiso C15β-羥基脂肪酸、iso C16β-羥基脂肪酸和 n C16β-羥基脂肪酸。這8種β-羥基脂肪酸的質譜圖如圖3所示。

圖1 脂肽樣品水解酯化后的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of methyl-esterified fatty acids from lipopeptide

圖2 脂肽樣品水解產物酯化后的提取離子色譜圖(m/z=103)Fig.2 Extracted ion(m/z=103)chromatogram of methyl-esterified fatty acids from lipopeptide

圖3 β-羥基脂肪酸甲酯的質譜圖Fig.3 MS spectrum of β-hydroxy fatty acid methyl esters

2.2 氨基酸組成

脂肽經過鹽酸水解后，斷裂產生游離的氨基酸。水解的產物與BSTFA硅烷衍生化后，通過GC-MS的方法檢測樣品中氨基酸的組分，檢測的總離子圖譜見圖4。圖4中有4個色譜峰，保留時間分別為9.9、10.9、14.1 和15.3 min，說明有4種主要成分。根據Aglient NIST 05質譜圖數據庫檢索結果，這4個峰依次為纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、天門冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)的硅烷化衍生物。圖5～圖8分別列出了4種氨基酸衍生物質譜圖。因此，脂肽樣品肽環部分由纈氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸4種氨基酸組成。

圖4 脂肽樣品水解后衍生化產物的總離子色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram derived from hydrolyzed lipopeptide sample

圖5 纈氨酸硅烷衍生化質譜圖Fig.5 Mass chromatogram of Val after trimethylsilylation

圖6 亮氨酸硅烷衍生化質譜圖Fig.6 Mass chromatogram of Leu after trimethylsilylation

圖7 天門冬氨酸硅烷衍生化質譜圖Fig.7 Mass chromatogram of Asp after trimethylsilylation

圖8 谷氨酸硅烷衍生化質譜圖Fig.8 Mass chromatogram of Glu after trimethylsilylation

2.3 氨基酸的連接順序

圖9是脂肽樣品的ESI-MS檢測質譜圖譜。陽離子方式檢測中質荷比為1058的質譜峰代表的組分是脂肽的［M+Na］+質譜峰;質荷比為1044、1030的質譜峰與質荷比為1058的質譜峰分別相差14和28，三者互為同系物，結構相差1個和2個CH2。與之對應的，在陰離子方式檢測質譜圖中出現了1034、1020和1006的［M-H]-質譜峰。

圖9 脂肽的電噴霧質譜檢測結果Fig.9 ESI-MS detection result of lipopeptide

以質荷比為1058的［M+Na］+離子作為先導離子，進行陽離子串聯質譜檢測，圖10是該離子峰的串聯質譜分析圖譜。脂肽在質譜中首先斷裂氨基酸殘基［10］離子碎片 1058、945、832、618 顯示了Leu-Leu-Asp-Val的氨基酸序列信息;離子碎片717、594、481、382、267 顯示了 Leu-Leu-Val-Asp的氨基酸序列信息。Surfactin肽鏈由7個氨基酸組成，且其比例為Val∶Leu∶Asp∶Glu=1∶4∶1∶1［5-8］。考慮到氨基酸的組成中有一個Asp和一個Val，氨基酸的鏈接順序為Leu-Leu-Asp-Val-Leu-Leu。根據雙氫轉移機制以及麥氏重排機理，環狀脂肽在串聯質譜分析過程中，內酯鍵所在的烷鏈上發生消除反應而將一分子水轉移至肽鏈的C 末端上，從而判斷肽鏈的 C 端［4，11］。碎片離子832與814相差恰好為18，是氨基酸殘基 H2OLeu-Leu與殘基Leu-Leu之間的質量差，表明Leu-Leu連接在C端，剩下的谷氨酸只能鏈接到N端，因此肽鏈連接順序為N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C。碎片離子1058與707對應于C12H25C=CHCO-Glu，表明該離子峰為C15surfactin，這也與脂肪酸分析結果吻合。

圖10 鈉離子化碎片(m/z=1058)的串聯質譜分析Fig.10 Tandem mass spectrum of sodium-ionized fragment(m/z=1058)

質荷比為1044和1030的離子峰串聯質譜分析結果表明:離子碎片1044和1030分別是C14脂肽和C13脂肽的［M+Na］+質譜峰，肽環氨基酸鏈接順序與離子碎片1058所代表的C15脂肽氨基酸連接順序相同，均為N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C。

表1 蒼白桿菌代謝產生的脂肽類型Table 1 The lipopeptides produced by Ochrobactrum sp.

結合GC-MS和MS/MS分析，篩選的這株蒼白桿菌代謝的脂肽為含有脂肪酸組成為iso C13β-羥基脂肪酸、anteiso C13β-羥基脂肪酸、iso C14β-羥基脂肪酸、n C14β-羥基脂肪酸、iso C15β-羥基脂肪酸、anteiso C15β-羥基脂肪酸、iso C16β-羥基脂肪酸和n C16β-羥基脂肪酸的脂肽混合物，肽環部分均由纈氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸4種氨基酸組成，氨基酸連接順序見表1。蒼白桿菌代謝產生的脂肽結構與surfactin相同，但其脂肽組成與報道的其他菌株產生的surfactin不同。串聯質譜圖中沒有檢測出C16surfactin對應的［M+Na］+質譜峰，因此無法分析其氨基酸鏈接順序。

3 結論

從油藏產出液中篩選到1株代謝產生脂肽的細菌，經鑒定為蒼白桿菌。這是首次報道蒼白桿菌能夠產生脂肽類化合物。脂肽中的脂肪酸由iso C13β-羥基脂肪酸、anteiso C13β-羥基脂肪酸、iso C14β-羥基脂肪酸、n C14β-羥基脂肪酸、iso C15β-羥基脂肪酸、anteiso C15β-羥基脂肪酸、iso C16β-羥基脂肪酸和n C16β-羥基脂肪酸組成;脂肽中的氨基酸由纈氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸組成。其中脂肪酸組成為 iso C13、anteiso C13、iso C14、n C14、iso C15和 anteiso C15β-羥基脂肪酸的脂肽，其氨基酸連接順序為N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C。該結構與surfactin的結構一致。故該蒼白桿菌代謝的脂肽為iso C13surfactin、anteiso C13surfactin、iso C14surfactin、n C14surfactin、iso C15surfactin、iso C16surfactin和 n C16surfactin的混合物，與目前報道的枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌及短短芽胞桿菌產生的surfactin的組成相同。

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