結核分枝桿菌融合抗原Rv3914－6His的原核表達、純化與抗原性檢測

蔡家麟，潘 欣*，王 穎，陳 敏，廖萬清

(1.第二軍醫大學，上海 200433;2.上海交通大學 基礎醫學院，上海 200025)

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的傳染病，結核分枝桿菌通常感染并破壞肺以及淋巴系統，而中樞神經系統、循環系統、泌尿系統、骨骼、關節、甚至皮膚等其他器官系統亦可受感染。結核病是目前僅次于HIV的第二大傳染病;中國是全世界第二大結核病高發國家，僅次于印度。因此，結核病的國內外防控形勢非常嚴峻。控制結核病流行的關鍵在于找到靈敏度高、特異性強、便于基層醫院廣泛使用的診斷方法。本研究選擇結核分枝桿菌 H37Rv菌株 Rv1908c、Rv0733、Rv0899、Rv1411c和Rv3914等5種結核分枝桿菌分泌性抗原作為血清學診斷抗原篩選對象。其中Rv1908c基因名為katG，抗原名為過氧化氫酶-過氧化物酶-過氧亞硝酸酶 T(catalase-peroxidaseperoxynitritase T)，分子量約80.57 ku，對分枝桿菌在巨噬細胞內存活有重要作用;Rv0733基因名為adk，抗原名為腺苷酸激酶，分子量約20.09 ku，對該菌在細胞內的核苷酸代謝發揮作用;Rv0899基因名為ompA，抗原名為外膜蛋白 A，分子量約33.54 ku，是維持細菌完整性的結構蛋白;Rv1411c基因名lprG，抗原名為保守脂蛋白，分子量約24.55 ku，功能未知;Rv3914基因名為trxC，抗原名為硫氧還蛋白，分子量約12.54 ku，可參與多種氧化還原反應。5種抗原經原核表達、純化，包被酶標板，采用間接ELISA方法比較了活動期結核病患者組和健康對照組血清中分別與5種結核分枝桿菌抗原反應的 IgG水平，探討了抗Rv1411c的IgG作為活動期結核病新的血清學標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與抗原 pET-32b-Rv0733、pET-32b-Rv1411c、 pET-32b-Rv1908c、 pET-32b-Rv0899、pET-32b-Rv3914質粒和Rv2031c-6His融合抗原為上海交通大學基礎醫學院王穎課題組保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 鼠抗6-His聚組氨酸標簽單克隆抗體，美國Abcam公司;預染蛋白質分子質量標準，Fermentas公司;IRDye 800羊抗小鼠IgG(H+L)綠色熒光二抗，美國Licor Biosciences公司;質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒，美國Axygen公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和His-Select鎳親和瓊脂糖微珠，美國Sigma公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)標記的山羊抗人IgM二抗和IgG二抗，美國Jakson公司;BL21(DE3)PLySs感受態細胞，日本TaKaRa公司;3 ku超濾離心管，美國Millipore公司;Odyssey雙色紅外熒光成像系統，購于美國 Licor Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 His-結核分枝桿菌抗原融合蛋白的表達與純化 分別將 pET-32b-Rv0733、pET-32b-Rv1411c、 pET-32b-Rv1908c、 pET-32b-Rv0899、pET-32b-Rv3914和 pET-32b-Rv2031c質粒轉化BL21(DE3)PLySs感受態細菌。挑取單克隆，保留測序正確的菌種用于抗原蛋白表達。

細菌接種200 mL LB培養基(含50 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃振搖至 A600為0.4 ～0.6 后，加入終濃度為0.1 mmol/L的 IPTG，30℃振搖6 h，進行誘導表達。7 000 g離心3 min，收集細菌沉淀;用20 mL細菌裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0)重懸菌體沉淀，超聲法充分裂解細菌;4℃ 8 000 g離心30 min，取上清，為粗提蛋白，經 0.45 μm 過濾器過濾后，加入1 mL鎳親和瓊脂糖微珠，4℃ 旋轉混合過夜;次日用含20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗滌，離心棄上清，以去除未與鎳親和瓊脂糖微珠結合或結合不緊密的雜蛋白;最后用含300 mmol/L咪唑的 PBS緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白。將洗脫純化的蛋白經3 ku超濾離心管超濾，去除咪唑等小分子，再用0.22 μm過濾器濃縮過濾，濾液加入終濃度為40%的無菌甘油，制成純化抗原蛋白樣品，置－80℃冰箱備用。

1.2.2 抗原蛋白的鑒定 以Rv1908為例，分別將粗提和純化后的抗原蛋白用Bradford方法進行蛋白定量，取等量總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍G-250染色，評估純化前后的效果。用5種純化的抗原經12%SDS-PAGE電泳分離，電轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene-fluoride，PVDF)，用含3%BSA的PBS封閉液室溫緩慢振搖封閉1 h后，再與1∶1 000稀釋的鼠抗6-His單抗4℃孵育過夜。洗膜后與1∶5 000稀釋的熒光標記的IRDye 800羊抗小鼠二抗室溫避光振搖孵育1 h。通過雙色紅外熒光成像系統掃描成像。

1.2.3 結核患者血清收集 本研究從上海市肺科醫院收集到34例活動期結核患者和35例健康體檢者血清(對照)，均已簽署知情同意書，臨床診斷基于發病史、體檢、胸部X射線、痰涂試驗陽性、分枝桿菌培養陽性等標準，患者基本信息與臨床病理特征見表1。此處健康體檢者的健康標準為不存在結核病史，不存在肺部感染。

表1 活動期結核病患者臨床與實驗室指標(n=34)Table 1 Clinical and experimental parameters of active tuberculosis patients(n=34)

1.2.4 間接ELISA法檢測血清中抗體 將純化抗原用包被液(15 mmol/L Na2CO3，35 mmol/L NaHCO3，pH 9.6)稀釋至 1 μg/mL，每孔 100 μL加入平底96孔Costar酶標板，4℃包被過夜;用含0.05%Tween 20的PBS洗滌3次后，每孔加入200 μL含1%明膠的PBS于37℃封閉1 h;血清用含1%明膠和0.05%Tween 20的 PBS按1∶100稀釋，洗板后每孔加入100 μL稀釋的血清，37℃孵育1 h;洗板后，每孔加入100 μL經1∶2 000稀釋的AP山羊-抗人IgG或IgM二抗，37℃孵育1 h;洗板后每孔加入100 μL對硝基酚磷酸二鈉(p-nitrophenyl phosphate disodium，pNPP)顯色液，避光反應30 min，每孔加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液終止顯色反應，于405 nm測定OD值。設課題組已有的Rv2031c-6His融合抗原包被的酶標板為陽性對照，健康體檢者血清為陰性對照，PBS為空白對照。抗原免疫原性檢測時，血清按梯度稀釋后使用。

1.2.5 統計學分析 所有數據分析均采用GraphPad Prism 5軟件。2組數據比較均運用Mann Whitney檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 結核分枝桿菌5種抗原蛋白的表達、純化及鑒定

將 pET-32b-Rv0733、pET-32b-Rv1411c、pET-32b-Rv1908c、pET-32b-Rv0899、pET-32b-Rv3914和pET-32b-Rv2031c 5種抗原原核表達質粒轉化BL21(DE3)PlySs，取測序正確的單克隆菌種經IPTG誘導后大量表達。以Rv1908c融合蛋白的表達純化為例，將細菌裂解上清及用鎳親和瓊脂糖微珠親和層析法純化的目的蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，結果可見相對分子質量90和70 ku附近的濃染條帶，與理論值(80.57 ku)大小相符(圖1)。

圖1 SDS-PAGE檢測Rv1908c-6His融合蛋白的表達和純化Fig.1 Expression and purification of Rv1908c-6His fusion protein detected with SDS-PAGE

將純化的5種天然融合抗原進行Western Blot檢測，在相應位置得到了目的條帶(圖2)，即約34.38 ku 的 Rv0899-6His融合蛋白、20.93 ku的Rv0733-6His融合蛋白、81.41 ku的 Rv1908c-6His融合蛋白、25.39 ku的 Rv1411c-6His融合蛋白和13.38 ku的Rv3914-6His融合蛋白。

2.2 ELISA檢測純化抗原融合蛋白的免疫原性

為監測純化抗原是否保留免疫原性，以純化后的Rv3914-6His融合蛋白為例和課題組已有的Rv2031c-6His融合抗原分別包被96孔酶標板，選擇保留較多血清的6位患者和1位健康體檢者的樣品，梯度稀釋血清，每個梯度做3個復孔。以Rv2031c-6His為陽性對照檢測的結果見圖3，以Rv3914-6His檢測的結果見圖4。提示純化的Rv3914-6His蛋白可以與血清中相關抗體結合，保留了較好的免疫原性。

圖2 雙色紅外熒光檢測結核分枝桿菌5種抗原融合蛋白Fig.2 The identification of five kinds of Mtb fusion antigens by two-color infrared fluorescence

圖3 Rv2031c-6His融合蛋白間接ELISA檢測血清IgG抗體Fig.3 Detection of serum IgG against with Rv2031c-6His fusion protein by indirect ELISA

2.3 ELISA篩查有診斷價值的融合抗原

在確認純化的融合抗原具有免疫原性后，分別使用5種純化的融合抗原和已有的Rv2031c-6His融合抗原包被酶標板，用間接ELISA方法檢測34位患者和35位健康體檢者血清中的IgG抗體，結果見圖5。同一融合抗原檢測的健康體檢者和患者IgG之間存在顯著區別的主要是Rv3914-6His融 合 抗 原 (PRv3914c=0.000 1)、Rv1411c-6His融合抗原(PRv1411c=0.004 3)和Rv2031c-6His融合抗原(PRv2031c=0.000 4)。

圖4 Rv3914融合蛋白間接ELISA檢測血清IgG抗體Fig.4 Detection of serum IgG against with Rv3914-6His fusion protein by indirect ELISA

圖5 結核分枝桿菌融合抗原間接ELISA檢測血清IgG抗體Fig.5 Detection of serum IgG against with Mtb antigene-6His fusion protein by indirect ELISA

受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線)是反映敏感性和特異性連續變量的綜合指標，也是分析生物標志物在疾病診斷中是否有運用價值的重要方法。比較活動期結核病患者和健康體檢對照組IgG抗體與受檢抗原反應的OD值，得到Rv3914-6His、Rv1411c-6His和 Rv2031c-6His ROC曲線(圖6)的 AUC 值分別為 0.786 7、0.586 7 和 0.754。由于ROC曲線的AUC值越大，生物標志物的診斷意義也越大，而Rv2031c(16 ku)是現在臨床上用來輔助結核病診斷的3種抗原之一，因此推測Rv3914也可能具有作為候選診斷抗原的應用價值。

圖6 Rv2031c-6His、Rv3914c-6His和Rv1411c-6His融合抗原診斷結核病的ROC曲線Fig.6 ROC curves of Mtb 6His fusion antigens in the diagnosis of TB

3 討論

近年來，隨著耐多藥結核病例的增長和人口流動性的增大，結核病給我國公共衛生帶來了巨大的壓力。如能加快速度提高診斷的準確率，可為結核病的早期治療以及治療方式的選擇提供依據，從而及時防止疾病的進一步擴散。結核病的細菌學檢查目前是結核病實驗室診斷的金標準，但因假陽性率高、需時長，診斷價值有限。血清學診斷由于操作簡便、快速，無需特殊精密儀器，便于自動化檢測，是目前臨床結核病診斷中應用最為廣泛的一種方法，國內臨床上主要使用針對定位在結核分枝桿菌質膜上的38 ku磷酸鹽轉運蛋白(38 ku)(適合活動性肺結核診斷，檢測敏感性為 91%，特異性為 97%)［1］、16 ku 的結核分枝桿菌主要蛋白抗原63(major protein antigen 63 of tuberculosis，MPT63;又名Rv2031c)抗原(種特異性抗原)(檢測敏感性為 52.5%，特異性為93.3%)［2］和分枝桿菌細胞壁的屬特異性抗原脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)(檢測敏感性為93%，特異性為100%)［3］3種抗原的血清學應答水平作為結核病的輔助診斷指標。近年來出現了一些關于結核病診斷的新技術，如基于PCR 原理的 Xpert-MTB/RIF［4］，能快速診斷耐多藥結核病，但是只能得知結核分枝桿菌的有無，無法確定其活性;基于特異性抗結核分枝桿菌細胞免疫應答的γ-干擾素釋放分析T-SPOT.TB檢測(T-SPOT)或 γ-干擾素體外釋放實驗(Quanti-FERON-TB Gold)是目前公認的較為準確和特異性的診斷手段，但是該方法價格高，操作具有一定的技術要求。因此，尋找更多的可用于臨床診斷的新技術和新方法仍是當前結核病研究中的重要內容。本研究選擇的5個抗原在結核分枝桿菌包膜蛋白的蛋白質組學研究中均有記錄［5-7］。其中，Rv1908c［8-9］、Rv0899［10］和 Rv3914c［11］都對結核分枝桿菌在不同壓力環境下的生存產生影響。以上5種抗原經原核表達、純化得到較高濃度的融合蛋白。由于使用原核系統表達的抗原蛋白存在失去免疫原性的可能，所以本研究將獲得的抗原經梯度稀釋后包被在ELISA酶標板上，使用相同稀釋度(1%)的血清作為一抗，結果顯示，表達的融合抗原保留了和患者血清中特異性抗體IgG的結合能力，可用作ELISA的包被抗原來檢測血清中相應的抗體。

ELISA試驗結果顯示，純化后的Rv3914-6His和Rv1411c-6His這2個抗原所檢測的臨床樣本(包括34例活動期結核患者和35例健康體檢者)中，患者血清中的IgG特異性抗體OD值顯著高于健康體檢者血清的OD值(PRv3914c=0.000 1，PRv1411c=0.004 3)，與作為臨床輔助手段的Rv2031c(AUC 值為0.754)相比，Rv3914(AUC 值為0.786 7)同樣具有作為血清檢測抗原的潛在可能。

除了Rv3914和Rv1411c外，其余的抗原雖然在健康體檢者和患者之間沒有顯著差別，但是Rv1908c、Rv0733和Rv0899在細胞水平或動物水平均被證實其突變對于結核分枝桿菌在人體內的長期生存起到相當重要的作用。當結核分枝桿菌感染巨噬細胞或被巨噬細胞吞噬后，這些蛋白分子可能才真正開始它們的工作。因此這些抗原可能有助于篩選結核分枝桿菌特異性胞內抗體。

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