1株喜鹽Actinopolyspora菌屬新種的系統分類

關統偉，趙輝平，車振明

(西華大學生物工程學院，四川成都 610039)

大英鹽湖位于四川省中部地區的遂寧市大英縣境內，1.5億年前地球的兩次造山運動在四川大英縣形成了地下古鹽湖盆地，含鹽量超過22%，其鹽鹵儲量達42億 t［1］。2011年自大英鹽湖中分離獲得1株極端嗜鹽產孢放線菌，菌株編號為TRM4064，經16S rRNA系統發育分析初步確定為1株潛在的新種，經形態學觀察、生理生化檢驗、細胞化學和分子遺傳學等多相分類手段的測定，確認菌株TRM4064為多孢放線菌屬(Actinopolyspora)的一個新種。研究目的是通過多相分類技術確定該菌種的系統分類地位。多相分類是采用現代分類的多種方法，綜合表現型和遺傳型信息進行分類鑒定和系統發育研究的過程，它是當前研究微生物各級分類單位最有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2011年12月自大英鹽湖樣品中分離獲得的1株極端嗜鹽放線菌，菌株編號為TRM4064。

1.1.2 主要試劑及儀器 QIAquik PCR純化試劑盒(QIAGEN)、蛋白酶 K(Merck)、Taq酶(TaKa-Ra)、dNTPs(TaKaRa)、DNA Marker(Sangon)，其他生化試劑均為國產分析純。凝膠成像儀(Biorad)、電泳儀(Bio-rad)、PCR 擴增儀(Bio-rad)。

1.2 方法

1.2.1 菌種形態特征觀察和生理生化實驗 用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株的形態和細胞的運動性。碳、氮源生長實驗采用Mata等［2］建議的培養基(NaCl 100 g，KCl 2 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，KNO31 g，(NH4)2HPO41 g，KH2PO40.5 g);抗生素敏感性實驗和其他生理生化實驗參照文獻［2-3］描述的方法進行。

1.2.2 菌種醌、脂肪酸及細胞全水解糖組分分析微生物細胞醌組分的提取和純化參照Collins［4］的方法，然后根據Groth［5］的方法，利用高壓液相色譜(HPLC)測定醌組分。細胞脂肪酸采用Sasser［6］的方法測定。放線菌全細胞水解糖分析主要參照Hasegawa等［7］描述的方法。

1.2.3 DNA(G+C)mol% 的測定與 DNA-DNA分子雜交 根據文獻［8］的程序對菌株TRM4064進行(G+C)mol%的測定，采用高壓液相色譜(HPLC)進行分析。DNA-DNA分子雜交方法主要依照 Ezaki［9］和徐麗華等［3］所描述的方法進行。

1.2.4 16S rRNA基因測定與系統進化分析DNA的提取和 PCR擴增程序采用 Hezayen［10］的方法，然后將PCR產物送上海生物工程公司測序。用Blast搜索程序從GenBank等公共數據庫中調出相似性較高的相關菌株的16S rRNA基因序列，用 CLUSTAL_X進行多序列比對，使用MEGA4.0 軟件采用鄰接法［11］聚類分析，并構建出系統進化樹。同時，重復取樣1 000次進行自展值分析來評估系統進化樹的拓撲結構的穩定性。

2 結果與分析

2.1 表型特征

菌株TRM4064是好養性微生物，具有很強的嗜鹽性，革蘭染色陽性，產生發達的孢子。氣生菌絲持續生長形成孢子鏈，孢子鏈上含有10個以上的孢子，孢子鏈呈直線型，孢子有橢圓形和圓柱形，表面光滑，不運動，不產生孢子囊，見圖1。

圖1 TRM4064菌株的電鏡照片Fig.1 Transmission electron micrograph of strain TRM4064

菌株TRM4064能夠在28～55℃范圍內生長，能夠耐受10% ～20%的NaCl鹽濃度，可以在pH值為6～8的培養基上生長。氧化酶實驗為陰性，過氧化氫酶實驗結果為陽性，吲哚實驗和甲基紅實驗結果為陰性。硝酸鹽不能夠被還原，牛奶凝固不被胨化，H2S實驗為陽性。Tween 20、Tween 40、Tween 60和 Tween 80水解，纖維素分解，明膠被液化，酪蛋白被水解，但淀粉和尿酶水解為陰性。藥敏實驗結果表明該菌對ampicillin(10 μg)、azithromycin(15 μg)、carbenicillin(100 μg)、chloramphenicol(30 μg)、gentamicin(120 μg)、erythromycin(15 μg)、lincomycin(2 μg)、nitrofurantoin(300 μg)、tobramycin(10 μg)、novobiocin(30 μg)、rifampicin(30 μg)、tetracycline(30 μg)、streptomycin(10 μg)和 vancomycin(30 μg)敏感，但對 kanamycin(30 μg)、polymyxin B(300 UI)和 nalidixic acid(30 μg)不敏感。菌株TRM4064另外的一些表型特征及其與最近的同源菌株的差異性見表1。在表型特征上實驗數據支持該菌為一個新的物種。

表1 菌株TRM4064與最近同源菌株的表型差異Table 1 Differential characteristics of strain TRM4064 and Actinopolyspora mortivallis

2.2 全細胞水解糖、醌、脂肪酸組分及其細胞壁磷脂分析

根據實驗結果分析，菌株TRM4064的主要的泛醌為 MK-10(H4)(38.2%)、MK-9(H4)(25.1%)、MK-9(H2)(28.6%)和 MK-8(H4)(7.3%)，TRM4064的主要泛醌與多孢放線菌屬的醌型基本一致，只是在含量上有一定的差異。如Actinopolyspora erythraea的優勢醌為MK-9(H4)(51.9%)，Actinopolyspora alba 的優勢醌為 MK-9(H4)(44.9%)和 MK-10(H4)(43.9%)［12］。菌株TRM4064細胞內主要的脂肪酸組分及其含量是 anteiso-C17:0(36.9%)和 iso-C17:0(19.3%)，這與親緣菌株Actinopolyspora mortivallis基本一致，在脂肪酸組分及其含量上與Actinopolyspora mortivallis有一定的差異性，具體的脂肪酸信息見表2。菌株TRM4064的全細胞水解糖分組成是木糖、葡萄糖、核糖和阿拉伯糖，與Actinopolyspora菌屬的細胞水解糖糖型一致。薄板層析法實驗結果表明菌株TRM4064的細胞磷脂是心磷脂、磷脂酰甘油、卵磷脂、磷脂酰肌醇和2個未知的磷脂類型，與該屬的磷脂組成相一致。

表2 菌株TRM4064與Actinopolyspora mortivallis的脂肪酸組成成分比較Table 2 Fatty acid profiles of strain TRM4064 and Actinopolyspora mortivallis

菌株TRM4064在全細胞水解糖、醌型、磷脂和脂肪酸組分分析上具有Actinopolyspora菌屬的典型特征，且存在一定的差異。因此，在細胞化學水平上支持菌株TRM4064為Actinopolyspora菌屬的一個新種。

2.3 16S rRNA系統發育分析與 DNA-DNA雜交

菌株TRM4064的16S rRNA基因序列測定結果表明，序列長度大約1 500 bp。采用EzTaxon server 2.1工具比較其菌株的16S rRNA基因與有效命名物種的序列進行序列比對，菌株TRM4064與Actinopolyspora mortivallis的同源性為98.8%，同Actinopolyspora菌屬另外有效命名的物種的相似性小于97%。因此，需要進行核酸雜交來驗證其是否為新的物種。根據Wayne等［13］的描述，DNA雜交值低于70%可作為不同的種。根據雜交結果菌株TRM4064同Actinopolyspora mortivallis的雜交值為23.2%，表明菌株TRM4064是在Actinopolyspora屬之內且不同于已知種的新物種。采用CLUSTALX軟件與已知親緣關系較近的物種進行序列比對，MEGA4.0軟件進行相似性計算、進化距離矩陣計算、聚類分析和系統進化樹的構建等系統發育分析，結果見圖2。

菌株 TRM4064系統發育表明，菌株TRM4064同親緣關系最近的Actinopolyspora菌屬的物種以極高的自展值(＞98%)聚類在一起，形成獨立的大分支單元，這與EzTaxon server 2.1工具分析的結果相一致。因此，系統發育分析表明菌株 TRM4064是 Actinopolyspora菌屬的一個成員。

圖2 菌株TRM4064同已知同源關系較近菌株的16S rRNA基因系統發育樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences，showing the phylogenetic relationships of the novel isolate TRM4064 and related taxa

2.4 (G+C)mol%測定

DNA的堿基組成具有種特異性，不受菌齡和外界因素的影響，是細菌分類和菌種鑒定的重要指標。根據實驗結果分析，菌株TRM4064的(G+C)mol%是66.3%，當前 Actinopolyspora屬已知有效命名種的(G+C)mol%范圍在66.0% ～69.0%之間。因此，菌株 TRM4064的(G+C)mol%與Actinopolyspora屬(G+C)mol%的范圍一致。

3 討論

多孢放線菌屬Actinopolyspora最早被Gochnauer等［14］在1975年首次分離得到，即嗜鹽多孢放線菌 Actinopolyspora halophila。當前 Actinopolyspora共含有5個有效命名的物種，即Actinopolyspora halophila、Actinopolyspora mortivallis、Actinopolyspora xinjiangensis、Actinopolyspora alba 和Actinopolyspora erythraea均分離自高鹽環境。菌株TRM4064分離自高鹽的鹽湖環境，采用多相分類技術有效證明了該菌株為Actinopolyspora屬的新成員，這一發現將進一步豐富Actinopolyspora屬的物種多樣性，從而為極端環境微生物資源的開發利用提供新的材料支撐。另外，云南大學微生物所對新疆、青海等地的高鹽環境進行了放線菌資源的系統學研究，發現了大量嗜鹽放線菌新物種［15］。這些極端環境中的嗜鹽放線菌是依賴于一種或多種極端物化因子的極端生命形式，它們構成了地球生命形式的獨特風景線，為更好地認知生命現象、發展生物技術提供了寶貴的材料源泉。

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