云南程海湖淡水真菌抗菌活性篩選

晉方佑，李治瀅，董明華，嚴(yán)亞萍，李紹蘭，楊麗源

(云南大學(xué)云南省微生物研究所，云南昆明 650091)

淡水真菌是指“真菌的全部生命循環(huán)或部分生命循環(huán)依賴于淡水環(huán)境”的真菌［1］。自從Ingold于1942年發(fā)現(xiàn)并報道了第一個淡水真菌［2］，這一領(lǐng)域發(fā)展迅速，不斷有新的屬、種被報道［3］。淡水真菌分布廣泛、種類多樣，大部分生長在動態(tài)水(小溪、河流、河川)或靜態(tài)水(湖泊、池塘、濕地、水庫)中［2］。由于淡水真菌生長環(huán)境與陸地環(huán)境的巨大差異，導(dǎo)致淡水真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性明顯不同于陸地真菌，已成為生物活性代謝產(chǎn)物的又一重要來源［4］。程海湖地處青藏高原與云貴高原的銜接部位，屬于淡水湖泊，海拔1 500 m，長年平均氣溫18.7℃，水溫20℃，是云南九大高原湖泊之一。特殊的水質(zhì)和環(huán)境，滿足了喜堿、喜溫、高光照的微生物的生長條件［5］。通常，特殊環(huán)境下的微生物種類分布及次生代謝產(chǎn)物與其他地域有所不同［6］。本文對程海湖淡水真菌的抗菌活性和活性菌株的種群進(jìn)行初步研究，為豐富我國淡水真菌資源庫以及新型生物藥的創(chuàng)制提供研發(fā)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 32個樣品于2010年12月采自云南永勝縣境內(nèi)的程海湖湖水(18個)及底泥(14個)。

1.1.2 指示菌 大腸埃希菌(Escherichia coli)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單孢菌(綠膿桿菌)(Pseudomonas aeruginosa)、木霉(Trichoderma sp.)、小克銀漢霉(Cunninghamella sp.)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、交鏈孢霉(Alternaria sp.)、疫霉(Phytophthora sp.)、白假絲酵母(Candida albicans)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、星形石膏樣毛癬菌(Trichophyton gypseum)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)，均由云南大學(xué)云南省微生物研究所菌種保藏室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 含青霉素的PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、酸化YM培養(yǎng)基;誘發(fā)真菌孢子培養(yǎng)基［7］;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和沙博弱氏培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 淡水真菌的分離 稱取10 g底泥樣品放入裝有100 mL帶玻珠無菌水錐形瓶中，180 r/min震蕩混勻30 min，并依次進(jìn)行梯度稀釋(10－2～10－4)，每個稀釋度分別取0.2 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上。水樣采用過濾收集方法，濾膜稀釋到10－2，每個稀釋度分別取0.2 mL稀釋液涂布。28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，待長出單菌落后轉(zhuǎn)移至PDA斜面上純化，獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 抗菌活性篩選 ①淡水真菌提取物的制備:參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行;②指示菌的培養(yǎng):將細(xì)菌接入營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、皮膚致病真菌接入沙博弱氏培養(yǎng)基斜面，置于37℃溫箱培養(yǎng);植物致病真菌接入PDA斜面，置于28℃溫箱培養(yǎng);③抗菌活性測定:采用紙片法，參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

1.2.3 活性菌株鑒定 采用插片培養(yǎng)法，依據(jù)菌落的形態(tài)特征，孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)孢方式，參照文獻(xiàn)［10-11］進(jìn)行分類鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 程海湖淡水真菌抗菌活性菌株及分布

以14株病原菌為指示菌，測定473株淡水真菌提取物的抗菌活性，有290株淡水真菌至少對1種指示菌有不同程度的抗菌活性，占總菌株的61.31%(見表 1)。

表1 程海湖淡水真菌抗菌活性菌株分布Table 1 Distribution of antimicrobial activity Freshwater fungi isolated from Chenghai lake

從表1可以看出，自湖水獲得176株淡水真菌，有122株具有抗菌活性，占湖水中菌株數(shù)的69.32%;底泥中獲得297株，有168株具有抗菌活性，占底泥中菌株數(shù)的56.57%。在抗菌活性菌株中，抑菌圈直徑10 mm≤d＜15 mm的活性菌株最多，有208株，占活性菌株數(shù)的71.72%，其中湖水有97株，占湖水活性菌株數(shù)的79.51%;底泥有111株，占底泥活性菌株數(shù)的66.07%。以上結(jié)果表明，程海湖淡水真菌中存在著廣泛的抗菌活性資源，并分布有高活性的淡水真菌，其抗菌成分值得進(jìn)一步研究。

2.2 程海湖淡水真菌抗菌活性菌株鑒定及分布

經(jīng)顯微形態(tài)和菌落形態(tài)觀察，將290株抗菌活性菌株鑒定為46個屬，優(yōu)勢屬是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和枝孢屬(Cladosporium)(見表2)，分別占活性菌株總數(shù)的12.76%，11.72%和11.03%。其中湖水中的活性菌株分屬于24個屬，底泥中抗菌活性菌株鑒定為36個屬，有14個屬是湖水和底泥共有的屬，有10個屬是湖水特有的，有22個屬只分布在底泥中，表現(xiàn)出程海湖淡水真菌抗菌活性菌株的種群多樣性。

2.3 程海湖淡水真菌的抗菌活性

對分離純化得到的473株淡水真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，測定程海湖真菌發(fā)酵液提取物的抗菌活性，結(jié)果顯示:淡水真菌對木霉Trichoderma sp.有拮抗作用的菌株最多，有200株，占總菌株數(shù)的42.27%;其次是對白假絲酵母 Candida albicans，有抗菌活性的菌株有195株，占總菌株數(shù)的40.95%;對其他病原菌有抗菌活性的菌株所占比例較低，均在30%以下，其中對小克銀漢霉Phytophthora sp.比例最低，僅占15.43%。此次研究共篩選到59株高抗菌活性菌株，占總菌株的12.47%，其中有32株對至少4株病原菌有較高抗菌活性(表3)。表明程海湖淡水真菌高抗菌活性菌株所占比例較高，且抑菌譜廣的菌株種屬分布廣，有必要進(jìn)一步確定其分類地位和次級代謝產(chǎn)物的成分。

表2 程海湖淡水真菌抗菌活性菌株鑒定及分布Table 2 Identification and distribution of antimicrobial freshwater fungi isolated from Chenghai lake

表3 程海湖淡水真菌的抗菌活性Table 3 Antipmicribial activity of Freshwater fungi isolated from Chenghai lake

續(xù)表3

3 討論

淡水真菌作為幾乎尚未開發(fā)的自然資源寶庫，蘊(yùn)藏著巨大的潛力，特別是淡水真菌因其代謝途徑復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類繁多，很多具有顯著的抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗蟲等生物活性［12］。很多新穎的活性化合物已逐漸從淡水真菌中報道，如Annulatascus triseptatus、Dendrospora tenella、Decaisnella thyridioides、Helicodendron giganteum、Kirschsteiniothelia sp.、Massarina tunicate、Ophioceras venezuelenseand、Stachybotrys sp.［13］。

本研究結(jié)果顯示，程海湖淡水真菌抗菌活性菌株分布廣，其屬種分布具有多樣性。活性菌株的優(yōu)勢屬為青霉屬，與郭瀟等［6］的研究結(jié)果一致，活性菌株所占比例較高，達(dá)到61.31%。由此可見，程海湖淡水真菌中存在著廣泛的抗菌資源，可作為重要的抗菌藥物的來源。為尋找新的、有效的、具有選擇抗性的抗菌藥物提供了一條新的途徑，今后應(yīng)對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入的研究。

［1］ Thomas K.Freshwater fungi.In:Introductory Volume to the Fungi(Part 2)［M］.Australia.Canberra，1996，1B:1-37.

［2］ Iuo Jing，Zhang Keqin，Cai Iei，et al.Freshwater Fungi in Mainland China［J］.Journal of Huazhong Agricultral University，2004，3(1):7-13.

［3］ Ingold C.T..Aquatid Hyphomycetcs of decaying Alder leaves［J］.Tram Britain Mycological Society，1942，(25):339-417.

［4］ 鄭維發(fā).真菌代謝產(chǎn)物的藥物發(fā)現(xiàn)—資源、問題和策略［J］.菌物學(xué)報，2011，30(2):151-157.

［5］ 周新麗，李治瀅，楊麗源，等.云南程海湖酵母菌多樣性及應(yīng)用［J］.微生物學(xué)報，2011，(4):547-553.

［6］ 郭瀟，雷曉凌，陳慶，等.湖光巖水體與泥層中真菌的分離鑒定及抗菌活性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26(2):145-148.

［7］ 彭小偉，楊麗源，周斌，等.植物黃花夾竹桃內(nèi)生真菌多樣性研究［J］.云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，25(增刊):28-31.

［8］ 李治瀅，楊麗源，李紹蘭，等.滇南黃草烏內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5):1027-1029.

［9］ 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1982:1066-1067.

［10］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

［11］H.L.巴尼特，B.B亨特著.沈崇堯譯.半知菌屬圖解［M］.北京:科學(xué)出版社，1977.

［12］董錦艷，申開澤，孫蓉.淡水真菌活性代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展［J］.菌物學(xué)報，2011，30(2):206-217.

［13］ Sun Rong，Gao Yan-Xiu，Shen Kai-Ze，et al.Antimicrobial metabolites from the aquatic fungus Delitschia corticola［J］.Phytochemistry Letters，2011，(4):101-105.