多位點序列分型在食源性金黃色葡萄球菌分型中的應用研究

呂國平，衛沛楠，徐保紅，蘆 飛

(石家莊市疾病預防控制中心，河北石家莊 050000)

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，簡稱金葡菌)可引起人和動物的機會性感染，食品受其污染的幾率也很高，是引起食物中毒的一種重要病原菌［1］。隨著食品衛生越來越受到重視，人們不僅關心食品金葡菌的污染問題，更關注金葡菌引起的食物中毒或其引起衛生事件的溯源問題。基因分型技術逐漸成為微生物學監控的重要手段，MLST技術是近年來才發展起來的一種新型分子分型方法，對細菌的溯源有重要意義，該方法具有分辨率高、數據可靠、重復性好、便于不同實驗數據比較，有利于全球范圍的分子流行病學數據標準化的優勢［2］。本研究應用MLST對從各類食物樣品中分離的18株金葡菌進行基因分型研究，了解本地區食源性金葡菌主要流行菌株的基因型特征，為進一步研究本地區食源性金葡菌所致食物中毒的分子流行病學調查提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 18株從2012年各類食品樣本中分離的金黃色葡萄球菌。

1.1.2 主要試劑和儀器 Baird-Parker瓊脂培養基(北京陸橋)，亞碲酸鉀卵黃增菌液(美國BD公司)，溶葡萄球菌酶(上海生工生物工程有限公司)，基因組提取試劑盒(德國 QIAGEN公司)，FRIOCELLⅢ型霉菌培養箱(德國MMM公司)，PrimeSTARTM高保真DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)，基因擴增儀(美國MJ Research)，Nanodrop2000微量分光光度計(美國 Thermo)，QIAXCL毛細管電泳儀(德國 QIAGEN公司)。PCR引物委托上海生工公司進行合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制備 從Baird-Parker瓊脂平板上挑取單個典型菌落接種于營養肉湯中，于37℃培養16 h，取1 mL菌液加入1.5 mL EP管中，8 000 r/min離心3 min，去上清，向沉淀中加入50 μg/mL溶葡萄球菌酶溶液(含20 mmol/L Tris·HCl，pH 8.0;2 mmol/L EDTA;1.2%Triton)200 μL，渦旋混勻后，37℃放置1 h。以下步驟按照QIAGEN DNA提取試劑盒操作說明進行，用Nanodrop2000微量分光光度計測定提取DNA的濃度，加超純水將濃度定至10 ng/μL，－20℃保存備用。

1.2.2 引物的選取 選取 www.mlst.net網站數據庫推薦的7個管家基因進行MLST分析，PCR反應選用該網站推薦的7對引物。7個管家基因及相應的PCR引物信息見表1。PCR引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

表1 用于MLST分析的管家基因及PCR引物Table 1 The housekeeping genes and PCR primers of MLST

1.2.3 PCR擴增及產物測序 PCR反應選用25 μL體系:5×PrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，模板 DNA(10 ng/μL)3 μL，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，加超純水至 25 μL;PCR 擴增條件:94 ℃預熱2 min，98 ℃ 10 s，68 ℃ 45 s，35 個循環，72℃延伸5 min;PCR產物經毛細管電泳出現目的條帶后，委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 測序結果處理與數據分析 雙向測序結果經 Sequencer軟件比對并拼接后，截取成與MLST國際數據庫中所對應標準序列長度一致的片段，將切割后的片段在線提交到MLST數據分析網站(www.mlst.net)進行分析，統計出各等位基因的編碼和ST序列型，利用BioNumerics軟件進行聚類分析，并繪制ST型別分布的區域圖。

2 結果與分析

2.1 管家基因各片段的PCR擴增和測序結果

所有實驗菌株均擴增出目的管家基因片段，PCR擴增條件有很好的穩定性和可重復性。7個管家基因的毛細管電泳圖譜見圖1。上述出現單一目的條帶的所有PCR產物送測序，測序結果良好，可用于MLST分型實驗研究。

圖1 7個管家基因片段的擴增結果Fig.1 The PCR products of seven housekeeping genes

2.2 MLST 分型結果

18株食源性金葡菌7個管家基因片段的測序結果經比對后拼接成標準序列長度，與國際MLST網絡數據庫中的目標序列進行比對，結果見表2。通過MLST分析，得到10個ST序列型，分別是 ST5型、ST6型、ST7型、ST9型、ST15、ST59型、ST464型和ST2138型;另外還有2個新的ST型別。其中 ST5序列型最多，共5株;其次為ST464序列型，共3株;ST7型和ST15型各2株;ST6型、ST9型、ST59型和ST2138型各1株。

表2 MLST數據分析結果Table 2 The data analysis results of MLST

2.3 聚類分析結果

利用BioNumerics軟件對各菌的等位基因碼進行聚類分析，MLST分型結果見圖2，結果顯示18株食源性金葡菌共分為4個簇(A、B、C和D)和10個基因型。其中A簇含4個基因型(7株)，分離自熟肉制品、豆制品和焙烤及油炸食品;B簇含3個基因型(8株)分離自熟肉制品、焙烤及油炸食品、豆制品和涼拌菜;C簇含2個基因型(2株)，分離自熟肉制品和豆制品;D簇含1個基因型(1株)分離熟肉制品。

2.4 型別的區域分布

ST6型和ST7型金葡菌在平山縣有分布，ST464型金葡菌在行唐縣有分布，ST5型金葡菌在無極縣有分布，ST5型和ST9型金葡菌在正定縣有分布，ST15型、ST464型和ST2138型在趙縣有分布，ST59型在石家莊市出現軌跡，見圖3。

圖2 食源性金黃色葡萄球菌的MLST聚類分析圖Fig.3 The MLST clusters of foodborne Staphylococcus aureus

圖3 ST型別地理位置分布圖Fig.3 The geographical distribution diagram of ST type

3 討論

金黃色葡萄球菌作為引起細菌性食物中毒的一種重要病原菌，具有致病因子種類多、毒力強、在環境中分布廣泛、抵抗力強等特點，食品受到其污染的機會很多。因此對食源性金葡菌進行基因分型，可以為食品安全監控提供理論指導，同時，為控制其流行及臨床采取有效防控措施提供理論依據。

MLST由多位點酶凝膠電泳(MLEE)改進而來［3］。MLEE屬于表型分型方法，通過生物個體間多位點酶的差異來反映其遺傳基礎的差異。MLST技術并不分析基因的表達產物，而是分析基因的核苷酸序列。該技術所選擇的基因位點序列通常位于其管家基因內部，長度一般為500 bp左右。這類管家基因在待測菌株中的存在性接近100%，并且有足夠的變異度［4］。金葡菌的MLST技術針對其共有的7個管家基因設計引物，然后進行PCR擴增和產物測序，得到每個菌株各個位點的等位基因序號，繼而進行等位基因圖譜或序列類型(sequence types，STs)鑒定，最后再根據等位基因圖譜，使用UPGMA等聚類方法構建系統進化樹圖［5］。MLST技術在實驗過程的可操作性及實驗結果的可靠性之間取得了平衡，同時該方法簡便快捷、重復性強、分辨率高［6-7］;此外，各實驗室獲得的MLST數據可提交到已建立的MLST大型國際數據庫中進行比對，為全球金黃色葡萄球菌的流行病學研究提供了一個便捷的平臺。該方法適用于長期的、大范圍的流行病學調查(如全球流行病學調查)，研究菌株的起源和進化。

通過對分離的18株食源性金葡菌進行MLST分型研究發現，本地區金黃色葡萄球菌的ST型別比較豐富，ST型別地域分布比較明顯，MLST各聚類簇與地域之間沒有明顯的關聯。本地區優勢株主要為ST5型和ST464型等國際流行株，此外還新發現2株國際數據庫尚未收錄的新的基因型別，現已提交國際數據庫等待確認后進行編號收錄，以供各國實驗室參考比對。由于本實驗所涉及的菌株數量較少，所以研究該時間點的地區分布受限，但是對金葡菌進行MLST分型并對其進行地理位置的標注，為進行金葡菌分子流行病學的研究提供了重要的實驗室數據，為今后分析金葡菌引起的食物中毒打下了基礎。

［1］ Elena Ortega，Hikmate Abriouel，Rosario Lucas，et al.Multiple roles of Staphylococcus aureus enterotoxins:pathogenicity，superantigenic activity，and correlation to antibiotic Resistance［J］.Toxins，2010，2(8):2117-2131.

［2］ Katherine M.E.Turner，Edward J.Feil.The secret life of the multilocus sequence type［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2007，29(2):129-135.

［3］ Cooper J E，Feil E J.Multilocus sequence typing what is resolved［J］.Trends Microbiol，2004，12(8):373-377.

［4］ Pullinger G D，López-Benavides M，Coffey T J，et al.Application of Streptococcus uberis multilocus sequence typing:analysis of the population structure detected among environmental and bovine isolates from New Zealand and the United Kingdom［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72(2):1429-1436.

［5］ Maiden M C，Bygraves A，FeilE，et al.Multilocus sequence typing:a portable approach to the identification of cloneswithin population of pathogentic microorganism ［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1998，95(6):3140-3145.

［6］ 鄧小玲，管大偉，黎薇，等.多位點測序分型技術在病原微生物分型鑒定中的應用［J］.微生物學通報，2007，34(6):1188-1191.

［7］ 劉佳妍，金莉莉，王秋雨.細菌基因組重復序列PCR技術及其應用［J］.微生物學雜志，2006，26(3):90-93.