不同栽培條件辣椒疫霉菌ITS序列同源性分析

王 輝，劉長遠*，王 鐸，趙奎華，梁春浩，關天舒

(1.遼寧省農業科學院植物保護研究所，遼寧沈陽 110866;2.沈陽農業大學植物保護學院，遼寧沈陽 110866)

辣椒疫病是辣椒生產上的重要病害［1］，一般可造成產量損失20% ～30%，重者可達90%以上，甚至絕產。調查發現在遼寧地區設施和露地栽培條件下由該病菌引起的辣椒疫病田間癥狀有所不同，在露地辣椒栽培條件下該病害多發生于辣椒果實、葉片和根莖部位，而在設施辣椒栽培條件下多發生在根莖部位，葉片和果實上很難看到危害癥狀。目前對于該病害名稱大體有兩種說法，朱輝等［2］認為設施辣椒生產上該病害為辣椒根腐病，而大部分學者稱為辣椒疫病。對于遼寧地區這兩種栽培形式的疫霉病菌同源性研究尚未見報道［3-5］。本研究從設施和露地栽培條件下采集病害病樣，開展了病菌分離鑒定、形態學、致病性及ITS同源性分析，為該病害的診斷及防治提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集 2009至2010年，在遼寧省沈陽、撫順、本溪、營口等地區采集設施和露地辣椒不同栽培條件下的病樣，帶回實驗室分離培養。

1.1.2 供試培養基［6］CDA培養基:胡蘿卜200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.3 供試辣椒品種與育苗 茄門椒，由遼寧省農業科學院蔬菜所辣椒組提供。將供試辣椒品種種子均勻放入滅菌的鋪有雙層濾紙的玻璃皿中，置于28℃恒溫箱中催芽4～5 d，待芽長至1 cm左右時，播種到裝有滅菌土壤的營養缽中，當辣椒苗長出9～10片真葉時接種病原菌。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 選取具有典型癥狀的發病組織，先用清水將病組織沖洗干凈。將病組織的病健交界處切成小塊，然后用70%的酒精浸泡2 min，再用0.1%的升汞消毒1 min，最后用無菌水沖洗3～4次，置于CDA培養基上，25℃恒溫箱中培養，3～4 d后，挑取菌落，轉接到新的CDA培養基上純化培養，保存備用。

1.2.2 病原菌致病性測定 采用菌碟法接種，將分離的菌株放到CDA培養基上25℃培養4 d，用打孔器打成菌碟，在靠近辣椒植株1～2 cm處接入土中，每株接2個菌碟，以未接菌為對照，每個病菌接種辣椒秧苗30株，置于培養室25℃培養，10 d后調查病害發病情況。

1.2.3 病菌形態觀察 將病菌接種到CDA培養基上，25℃培養4 d，觀察菌落形態。將培養好的病菌菌碟針刺接種在辣椒果實上，25℃培養，7 d后刮取辣椒果實發病部位，在光學顯微鏡下觀察孢子囊的形態特征。

1.2.4 病菌基因組DNA的提取 將培養好的疫霉菌接種于CDA液體培養基中，28℃下120 r/min搖床培養，7 d后濾出菌絲，將菌絲冷凍抽干，加液氮研磨成粉末樣品。樣品中加入900 μL提取buffer和0.5 g石英砂，用核酸提取儀破碎30 s。加入蝸牛酶∶溶菌酶∶纖維素酶(6∶3∶1)終濃度10 mg/mL，輕輕混勻，37℃水浴1 h。加入20%SDS旋勻，65℃水浴30 min。降至室溫后，8 000 r/min，離心10 min。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，12 000 r/min，離心10 min。取水相，加入等體積的氯仿∶異戊醇混合液(24∶1)，顛倒混勻，12 000 r/min，離心10 min。取水相，加入0.1倍體積NaAc(3 mol/L)和0.6倍體積的異丙醇，室溫放置2 h。然后用70%乙醇洗滌，14 000 r/min，4℃，離心10 min。干燥后加入50 μL TE，－20℃保存。

1.2.5 ITS序列的擴增 ITS基因序列的擴增采用真菌的通用引物 ITS4、ITS5。ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。PCR反應體系:Mix 12.5 μL、模板 1 μ L、ITS40.5 μL、ITS50.5 μL、無菌雙蒸水定容至25 μL。PCR程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s;55℃退火30 s;72℃延伸1 min，30個循環;72℃溫育5 min。

1.2.6 序列的測定 PCR產物委托上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.7 序列同源性比較 測序結果與GenBank中已收錄的序列進行同源性比對，并利用clustalx 1.83和MEGA 4.0繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化

對不同地區不同栽培形式下采集的病樣進行分離培養和純化，得到了 BX6、FS8、SY4和 YG9菌株。其中營口的YG9、沈陽的SY4為設施栽培條件分離得到的菌株，本溪的BX6、撫順的FS8為露地栽培條件分離得到的菌株。

2.2 病菌致病性測定

將分離純化的4株菌接種于辣椒植株，結果表明接種10 d后辣椒植株全部出現萎蔫，植株莖基部變黑或變褐壞死，與田間病害發病一致，未接種辣椒植株均未發病，結果見表1。

表1 不同地區分離辣椒疫病菌株致病性測定Table 1 Pathogenicity determination of isolated strain from different areas

2.3 病原菌形態觀察

圖1 辣椒疫霉菌孢子囊形態1:BX6;2:FS8;3:SY4;4:YG9Fig.1 The morphology of the sporangium of Phytophthora capsici

挑取純化的露地病原菌BX6、FS8和設施病原菌SY4、YG9分別接種到CDA培養基上培養，4 d后菌落表現一致，菌絲茂盛，呈白色，絨毛型，菌絲纏繞比較緊密，不易挑取菌絲，培養基不變色。挑取發病果實的BX6、FS8、SY4、YG9病菌顯微鏡觀察，結果4株病菌形態一致，病菌孢子囊橢圓形、近球形、倒梨形，大小為(45.3～57.6)μm ×(29.2～35.4)μm，有乳突(圖1)。經鑒定 BX6、FS8、SY4、YG9菌株均為辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)。

2.4 病菌ITS rDNA擴增

將提取的4株病菌的DNA，經PCR擴增，電泳檢測，擴增出4條900 bp左右的核苷酸片段，見圖2。經序列測定，BX6 ITS序列長度為872 bp，(G+C)%為48.6%;FS8 ITS序列長度為857 bp，(G+C)% 為 48.1%;YG9 ITS 序列長度為873 bp，(G+C)%為48.2%;SY4 ITS 序列長度為872 bp，(G+C)%為 48.5%。

圖2 辣椒疫病菌PCR擴增結果M:Marker;1:BX6;2:FS8;3:YG9;4:SY4Fig.2 PCR amplifications on Phytophora capsici

2.5 同源性分析

由圖3 可知，BX6、FS8、SY4、YG9 4 株病菌與GenBank中的已知相關序列親緣關系極近，設施和露地的辣椒疫病病原菌在遺傳信息上差異性很小，它們為同一種疫霉病菌的可信度在99%。

3 討論

疫霉病菌是辣椒生產上重要的致病菌，由該病菌侵染的病害可造成嚴重的產量損失。經對設施和露地栽培條件下采集病樣分離鑒定，病原菌BX6、FS8和設施的病原菌SY4、YG9形態一致，菌落白色，呈絨毛狀，孢子囊大小為(45.3～57.6)μm ×(29.2 ～35.4)μm，有乳突［7-8］。ITS 序列分析，BX6、FS8、YG9和SY4菌株均與 GenBank中的疫霉菌有極高同源性，該病原菌均為辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)。造成在遼寧地區設施和露地栽培由該病菌引起的辣椒病害發生部位有所不同的原因，可能是栽培環境條件所致［9］。

目前對于該病害名稱大體有兩種說法，朱輝等［2］認為設施內疫霉菌引起的根腐病害為辣椒根腐型疫病，而楊學輝等［10］、張海英等［11］大部分學者稱為辣椒疫病。為了規范名稱，防止混亂，建議統一將該病害稱為辣椒疫病。由于在不同栽培形式下病害發生部位不同［6］，在使用甲霜靈、克露等藥劑防治辣椒疫病時，建議設施辣椒栽培下以藥液灌根，或拌成藥土穴施為主，露地辣椒栽培下以藥液噴灑、灌根或拌成藥土穴施為主［12］。對于造成不同栽培條件下辣椒疫病發生不同部分原因有待進一步研究。

圖3 辣椒疫病菌ITS序列與已知相關序列的遺傳進化樹Fig.3 The genetic evolutionary tree of Phytophthora capsici ITS sequence assoiated with the known sequences

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