抗桃根癌病菌的耐氰放線菌篩選及其抑菌作用研究

王樹芳，季敬霖，薛紅燕，馬煥普，劉志民

(北京農學院植物科學技術學院，北京 102206)

桃樹根癌病(亦稱冠癭病)是由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一種世界范圍的植物細菌腫瘤病害［1-3］，我國各地桃樹栽培區均有發生，發病率有的高達100%［4］。植株一旦染病，很難治愈，輕則衰弱黃葉，重則死樹。生物防治是一種對果樹根癌病有效的防治方法，利用微生物進行根癌病的生物防治已有不少報道［5］，但實際應用的并不多。因為桃樹根系會分泌一種物質即扁桃甙(氰的配糖體)，在微生物的作用下分解為苯甲醛和氫氰酸(HCN)。HCN對桃樹根系的毒害已被許多研究證明［6-8］，它不僅抑制桃樹根系的呼吸，而且對桃根際微生物的體系產生不良影響，使有益微生物減少，根系生長不良，容易遭受澇害、凍害等不利環境的傷害，從而引起根癌病等根部病害的發生。保持根際微生物的生態平衡，增加有益微生物的數量是減少根癌病發生的重要手段。所以篩選適應桃根際土壤有氰環境的生物菌，在生產中有重要意義。通過多年的研究從罹根癌病樹的根部土壤中篩選出了具有耐氰作用的放線菌G-19。經生理生化特性、形態特征及16S rDNA分子鑒定表明，此菌屬于鏈霉菌屬［9］，對桃根癌菌具有很好的抑制作用。分析鑒定其抑菌物質為含糖基的多肽［5］，本文主要報告的是該菌株的篩選方法及抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

受試菌株 桃根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)由中國農業大學提供。

1.2 方法

1.2.1 抗氰放線菌篩選 取桃病根土10 g，置于100 mL 磷酸緩沖液中(NaCl 8 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2)，輕微震蕩使土壤充分分散。將上清液分別逐級稀釋至10－8、10－4和 10－2倍。取上述系列土壤懸液，在無菌條件下，均勻地涂于加有不同濃度氰化鉀溶液的高氏培養基平板上，氰化鉀濃度為10、20和40 mg/L，每一個濃度都重復3皿，在28℃恒溫下培養。待平板上出現單菌落時，在無菌條件下從平板上挑取菌落顏色、形態等培養性狀不同的放線菌單菌落，移入加有0.3 g/L K2Cr2O7的改良高氏培養基平板上，重復篩選，直至所篩菌株在培養基中的外部形態、菌落顏色等完全一致。

1.2.2 根癌菌拮抗放線菌篩選及其生理生化指標的測定 取上述篩選好的21株放線菌菌株各1環，置于150 mL高氏液體培養基中，28℃、180 r/min震蕩培養7 d。挑取1環供試菌株根癌農桿菌于100 mL的LB液體培養基中，31℃、200 r/min震蕩培養24 h。取150 μL供試菌株菌懸液置于牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，涂布均勻，待干。用滅過菌的打孔器圍繞平皿周圍打孔，再注入100 μL發酵好的放線菌發酵液，31℃恒溫培養24 h，觀察抑菌圈的形成，篩選出抑菌效果最好的放線菌菌株。①形態特征觀察:采用插片法［10］觀察菌株的形態特征。具體方法是在無菌條件下，將菌株G19接種到高氏一號固體培養基上，插片，在28℃下培養6 d。然后在電子顯微鏡下觀察菌株的形態;②培養性狀觀察:采用國際鏈霉菌計劃(ISP)和Waksman推薦的培養基，在無菌條件下，分別將菌株G19接種在高氏一號培養基、改良HV培養基、察氏瓊脂、葡萄糖酵母膏培養基、葡萄糖天冬酰胺瓊脂、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6等培養基上，28℃培養，7 d后觀察菌株在各種培養基上的特征;③生理生化特性觀察:依據《放線菌的分類和鑒定》［11］、《鏈霉菌鑒定手冊》［12］對放線菌菌株G19進行各種生理生化特性測定;④分子手段鑒定:采用16S rDNA序列分析方法［13］，確定菌株所在種屬。

1.2.3 耐氰放線菌有效抑菌物質的粗提 將耐氰放線菌菌株置于高氏液體培養基中，28℃、180 r/min震蕩培養7 d，將發酵液離心(10 000 r/min，15 min)后得上清液，用無菌濾膜過濾，然后加入(NH4)2SO4至60%飽和度，靜置2 h，10 000 r/min離心10 min，取沉淀物置于截流分子量為8 000～14 000 u的透析袋，在0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)中透析過夜，然后10 000 r/min低溫離心10 min，棄不溶物，將上清液冷凍干燥后得粗提物。利用高效液相色譜儀、中壓制備色譜儀、MALDITOFMS等方法，初步確定粗提物中的抑菌物質為小分子糖基多肽，分子量范圍900～1 300 u［5］。

1.2.4 有效抑菌活性檢測 在涂好根癌農桿菌的平板中，用滅過菌的打孔器圍繞平皿周圍打孔，分別注入放線菌原發酵液、放線菌上清、(NH4)2SO4沉淀上清、粗提物、無菌水各100 μL，同時以磷酸緩沖液和無菌水做對照，28℃恒溫培養12 h，觀察抑菌圈大小。

1.2.5 粗提物對根癌農桿菌生長影響的測定取1 mL培養24 h的根癌農桿菌液體和8 mL無菌水置于20 mL離心管中，分成2組，每組3次重復，其中1組每個離心管內加1 mL粗提物，另1組加1 mL無菌水為對照。2組離心管在28℃、180 r/min震蕩培養24 h，分光光度計OD600檢測菌體含量變化。

1.2.6 粗提物對根癌農桿菌細胞壁形態的測定分別取上述1 mL 2組根癌農桿菌于1.5 mL離心管中，按照付洪蘭［14］的方法進行前處理，并電鏡觀察菌體細胞壁的形態變化。

1.2.7 粗提物對根癌農桿菌細胞膜通透性的測定 取6個10 mL離心管分別加入30 μL培養24 d的根癌農桿菌培養液及6 mL無菌水，分成2組，1組加粗提物，1組加無菌水為對照，28℃、180 r/min 震蕩培養，分別于0、6、12、24、48 h 測量電導率，觀察對細胞膜通透性的影響。

1.2.8 粗提物對對根癌農桿菌DNA損傷檢測采用單細胞凝膠電泳法(SCGE)檢測粗提物對根癌農桿菌DNA受損傷情況。實驗按照Kruszewski等(1998)的方法進行［15］，熒光顯微鏡觀察，如果DNA有損傷則會有拖尾現象出現。

2 結果與分析

2.1 耐氰放線菌篩選與抑菌活性檢測的結果

從病樹根土中經過耐氰篩選得到較純的放線菌菌株共21株，通過對桃根癌病原菌抑菌活性篩選，發現序號為G19的菌株抑菌作用最明顯，抑菌圈直徑為 21.66 mm，故命名為放線菌 G-19(圖1)。

圖1 根癌病拮抗放線菌篩選圖Fig.1 Screening of Actinomycetes against Agrobacterium tumefaciens

粗提物對桃根癌農桿菌的抑菌效果如圖2所示，原發酵液和粗提物有較高的抑菌活性;去除菌體后的上清液和硫酸銨沉淀后的上清液也有一定的抑菌效果。

圖2 有效活性成分的抑菌活性Fig.2 Result of antibacterial experiment

2.2 菌株G-19的培養特征及生理生化特性

G-19在高氏一號培養基上，菌落最初為白色，之后逐漸變為淺灰色，生長良好。氣生菌絲有分支、不斷裂、無橫隔，孢子橢圓形表面光滑(圖3)。基內菌絲在不同的培養條件下呈現的顏色也不同。不利用纖維素、甘露醇和甘露糖，不能使牛奶胨化。將G-19的16S rDNA序列進行校對，在GenBank中進行比對，確定G-19為鏈霉菌屬，由于沒有與之相似度較高的鏈霉菌，初步認定G-19為一個新菌［9］。

圖3 放線菌G-19的生長狀態Fig.3 Characters of G-19

2.3 耐氰放線菌G-19代謝產物的抑菌作用

2.3.1 對根癌農桿菌生長周期的影響 圖4顯示，對照組的根癌農桿菌首先出現一個快速生長的對數期，其次出現一段時間的穩定期，是一個典型的S型生長曲線;而加了粗提物的處理組，根癌農桿菌也有一個快速增長的過程，但周期明顯縮短，隨著時間延長，根癌農桿菌保持較低的生長水平。可見，粗提物的確抑制了桃根癌農桿菌的菌體生長。

圖4 粗提物對根癌農桿菌生長的影響Fig.4 Inhibitory effect of crude extract on growth of Agrobacterium tumefaciens

2.3.2 對根癌農桿菌細胞壁形態及菌體的影響圖5顯示，對照組菌體細胞表面光滑、飽滿，兩端鈍圓，細胞壁結構完整，細胞質均一(圖5A、B);而加粗提物12 h后，菌體細胞壁明顯發生彎曲、皺縮，有的部位甚至突起(圖5C)。加粗提物24 h后，細胞體積明顯變小而萎縮，細胞受損，細胞壁發生破裂，在破裂處有細胞質液泄出，細胞質向邊緣凝聚，中心變得稀薄，甚至形成空腔(圖5D)。由此可知，隨著時間的延長，根癌桿菌的細胞壁形態變化加劇。

2.3.3 對根癌農桿菌細胞膜通透性的影響 圖6顯示，對照組中，隨著根癌農桿菌的生長，電導率只有小幅度的增加，說明細胞膜的通透性沒有明顯改變;而處理組中，從加粗提物后6 h開始電導率明顯增加，24 h后增加幅度更大。說明粗提物改變了桃根癌農桿菌細胞膜的通透性，甚至可能使細胞質液外泄，導致電導率大幅增加。

圖5 透射電鏡下根癌農桿菌的細胞壁形態及菌體的變化Fig.5 Structure of Agrobacterium tumefaciens.Cell wall under transmission electron microscope

2.3.4 對根癌農桿菌DNA的影響 單細胞凝膠電泳后，通過熒光顯微鏡觀察顯示(圖7)，無論在對照組還是處理組中，根癌農桿菌的DNA均呈現規則的圓形，分布均勻，未出現拖尾現象。可見，粗提物未能損傷到根癌農桿菌的DNA。

綜上所述，粗提物的抑菌機理主要作用在病原菌的細胞壁和細胞膜上，通過改變其細胞膜的通透性而抑制其生長，對DNA沒有影響。

圖6 粗提物對根癌農桿菌細胞膜通透性的影響Fig.6 Effect of crude extract on cell membrane of A.tumefaciens

圖7 根癌農桿菌熒光SCGE圖片Fig.7 SCGE of Agrobacterium tumefaciens under fluorescence microscope

3 討論

目前對根癌病最有效防治的措施是以農業和生物防治為主，篩選出高效、適用生產的生防菌是根癌病生物防治的基礎和必要條件。前人在生防菌的篩選方面做了大量的工作，利用微生物進行根癌病生物防治也有不少報道，已先后用不同方法獲得了拮抗菌株 K84、MI15、HLB-2、J73、K1026、E26、H6、WJK84-1 等，對根癌土壤桿菌都有拮抗作用［5］。但多數生防菌與根癌菌屬于同一個屬，在新的分類體系中有的還是同一個種，它們之間有很多相似或相同的特性。并且，此類生防菌能否耐受桃樹根際的有氰環境尚未見報道。放線菌G-19是從桃根癌病樹根土中，以高濃度氰化鉀為篩選條件，篩選出的具有抗氰作用的放線菌，該菌屬于鏈霉菌屬，與根癌菌沒有相似的形態特征，在實驗室條件下有明顯的抑制效果。因此，本研究為根癌病生防菌的篩選和田間防治提供了新的途徑。

關于根癌病生物防治的抑菌機理有不少報道，研究表明K84菌株產生的抑制根癌病病原菌的重要物質是土壤桿菌素Agrocin84，它主要抑制病原菌體細胞的 DNA復制，從而實現防治作用［16］。此類抑菌素均為一種核苷類似物，通過干擾核酸的合成而起到抑菌的作用。能防治根癌病的還有一類物質即細菌素，是在細菌代謝過程中合成并分泌到環境中的一類對同種或親緣關系較近的有抑(殺)作用的蛋白或多肽類物質［17］。它們通過影響蛋白質的合成而抑制櫻桃冠癭瘤病原菌 C58［18］。

本研究篩選的拮抗放線菌對病原菌的抑菌作用機制與上述有所不同，主要是使病原菌生長的對數期縮短，病原菌細胞膜的通透性增加，細胞受損萎縮而死亡，而對菌體內的核酸含量變化未產生影響。

［1］ Decleene M，Deley J.The host range of crown gall［J］.Bot Rev，1976，42:389-466.

［2］ Kerr A.Biological control of crown gall through production of Agrocin84［J］.Plant Disease，1980，64(1):25-30.

［3］ Conner A J，Dommisse E M.Monocot yledonus plants a shosts for Agrobacterium［J］.Int J Plant Sci，1992，153(4):550-555.

［4］ 馬德欽，王慧敏.果樹根癌病及其生物防治［J］.中國果樹，1995，(2):42-44.

［5］ 季敬霖，劉志民，馬煥普.桃根癌病菌拮抗放線菌抑菌活性物質的分離及其初步鑒定［J］.安徽農業科學，2011，39(15):9013-9016.

［6］ Israel D W，Giddens J E，Powell W W.The toxicity of peach tree roots［J］.Plant and Soil，1973，39(1):103-112.

［7］ Gur A，Cohen Y.Causes of soil sickness in replanted peaches.1.The role of cyanogenesis in peach soil sickness［J］.Acta Horticulturae，1988，233:25-31.

［8］ Gur A，Cohen Y.The peach replant problem-some causal agents［J］.Soil Biology ＆ Biochemistry，1989，21(6):829-834.

［9］ 焦秀穎，劉志民，馬煥普，等.一株根癌菌的拮抗放線菌菌株的初步鑒定及培養條件的研究［J］.北京農學院學報，2010，25(1):41-44.

［10］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［11］閻遜初.放線菌的分類和鑒定［M］.北京:科學出版社，1992.

［12］中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，1975.

［13］Benizri E.Replant diseases:Bacterial community structure and diversity in peach rhizosphere as determined by metabolic and genetic fingerprinting［J］.Soil Bio.＆ Biochem，2005，37(9):1738-1746.

［14］付洪蘭.實用電子顯微鏡技術［M］.北京:高等教育出版社，2004.

［15］Kruszewski M，Wojewodzka M，I wanenko T，et al.Application of the comet assay for monitoring DNA damage in workers exposed to chronic low-dose irradiation.II.Base damage［J］.Mutation Research，1998，416(1-2):37-57.

［16］王慧敏，隋新華，李健強，等.櫻桃根癌土壤桿菌及其對土壤桿菌素84敏感性的研究［J］.微生物學報，1998，38(5):381-385.

［17］Klaenhammer T R.Bacteriocins of lactic axid bacteria［J］.Biochimie，1988，70(3):337-349.

［18］王關林，姜丹，方宏筠，等.高產細菌素菌株WJk84-1的誘變篩選及其對櫻桃冠癭瘤病原菌抑菌機理的研究［J］.微生物學報，2004，44(1):23-28.