厭氧菌群SVY42產(chǎn)酶條件分析及產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離鑒定

趙 超，李 婷，鄧云金，劉曉艷，黃一帆，3，劉 斌*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002;2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

半纖維素是自然界中含量豐富的可再生資源，其含量僅次于纖維素含量。目前，國內(nèi)外報(bào)道主要集中在半纖維素降解單菌上，但單菌株很難將半纖維素復(fù)雜成分一步降解，并且在保持分解能力上存在一定問題。在半纖維素降解研究上，逐漸重視混合菌群的作用。半纖維素的主要組成部分是木聚糖，約占植物細(xì)胞干重的35%。木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、飼料和造紙等行業(yè)［1］。但是，木聚糖酶的低生產(chǎn)率和高成本依然是影響其規(guī)模化工業(yè)應(yīng)用的重要原因。因此，木聚糖酶高產(chǎn)菌的選育仍具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。從極端環(huán)境中篩選有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的木聚糖酶產(chǎn)生菌，是得到高效木聚糖酶的有效手段［2］。溫泉生態(tài)系統(tǒng)由于其生境的特殊性，蘊(yùn)藏著特殊的微生物資源與酶資源。本研究對(duì)采集自美國內(nèi)華達(dá)州大盆地溫泉樣品進(jìn)行富集，獲得了菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的半纖維素降解菌群，并從菌群中篩選到高產(chǎn)木聚糖酶厭氧菌株，通過16S rDNA序列、生理生化等方面對(duì)該菌進(jìn)行了初步分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 實(shí)驗(yàn)樣品為采集自美國內(nèi)華達(dá)州大盆地溫泉(41D 31'57.2"N，120 D 04'15.7"W;41D 32'03.4"N，120 D 04'23.9"W)的水樣和泥樣。

1.1.2 菌株和試劑 E.coli DH5α、載體 pMD18-T、Ex Taq DNA polymerase、dNTP mixture、dTTP、dCTP、T4 DNA Ligase(TaKaRa);瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Plasmid Mini Kit、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN);刃天青、L-cystein、木聚糖(Sigma)。

1.1.3培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基(g/L):KH2PO40.75，K2HPO41.5，NH4Cl 0.9，MgCl2·6H2O 0.4，NaCl 0.9，酵母粉 0.6，蛋白胨 2.0，L-cystein 0.5，10%FeSO40.3 mL，刃天青 1 mL，濾紙 10。富集培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH 8.0，加刃天青后煮沸驅(qū)氧15 min，冷卻后再加入L-cystein，并分裝至厭氧瓶或厭氧試管后，通氮?dú)馀懦鯕猓?21℃ 20 min高溫滅菌備用;②產(chǎn)酶培養(yǎng)基:在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別以1.0%的巨菌草、甘蔗渣、廢菇筒、CMC、木聚糖替換濾紙，制成不同碳源的產(chǎn)酶分析培養(yǎng)基;③木聚糖酶篩選培養(yǎng)基:在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，以1.0%木聚糖替換濾紙制成木聚糖酶篩選培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 厭氧菌群及產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選 取1.0 g樣品與10 mL滅菌生理鹽水于試管中混勻后，取適量體積的稀釋液接種于富集培養(yǎng)基中，接種量為1%，重復(fù)2次，置于40℃培養(yǎng)。等濾紙開始崩解時(shí)，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)富集。目標(biāo)分離菌群添加15%甘油后置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩．a(chǎn)木聚糖酶單菌的分離和純化采用亨蓋特(Hungate)厭氧滾管技術(shù)。將菌種接種于10 mL的厭氧管中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用無菌注射器將其梯度稀釋至 10－5、10－6，取 10－5、10－6各0.5 mL分別注射到約50℃的固體木聚糖酶篩選培養(yǎng)基中顛倒混勻，立即將厭氧管平放到冰上迅速滾動(dòng)凝固，置于40℃培養(yǎng)，重復(fù)此操作直至得到純培養(yǎng)物。目標(biāo)分離菌株添加15%甘油后置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌群不同碳源產(chǎn) CMC酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶分析 分別加入1.0%的巨菌草、甘蔗渣、廢菇筒、CMC、濾紙、木聚糖制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入1.0%的目標(biāo)菌群，發(fā)酵3 d后，測(cè)定CMC酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的酶活力大小。

1.2.3 菌群產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件分析 以木聚糖酶篩選培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1.0%，其他條件不變，置于25、37、42、55 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌群產(chǎn)木聚糖隨溫度變化情況;培養(yǎng)基初始 pH 分別調(diào)為 6、7、8、9、10，測(cè)定菌群產(chǎn)木聚糖隨pH值變化情況;培養(yǎng)基pH 8.0，置于42℃恒溫培養(yǎng)10 d天，每隔24 h測(cè)酶活，測(cè)定菌群產(chǎn)木聚糖隨時(shí)間變化情況。

1.2.4 產(chǎn)木聚糖酶菌株基因組DNA的提取及16S rDNA序列擴(kuò)增 采用CTAB/NaCl法提取目標(biāo)菌株基因組DNA［3］，利用通用擴(kuò)增16S rDNA基因的引物27F和1492R［4］，以目標(biāo)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件:94℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將 PCR產(chǎn)物回收，連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 E.coli DH5α，挑取陽性克隆子，送上海生工測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果在專門收錄典型菌株的網(wǎng)站EzTaxon database進(jìn)行比對(duì)分析［5］。

1.2.5 產(chǎn)木聚糖酶菌株系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 采用EzTaxon的在線工具進(jìn)行序列比對(duì)計(jì)算同源性，并利用軟件MEGA 4.0對(duì)相應(yīng)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［6］，利用 Clustal W 進(jìn)行比對(duì)，隨后采用Neighbor-joining方法建立進(jìn)化樹，同源關(guān)系的可靠性由自舉值(bootstrap)進(jìn)行評(píng)估(1 000次重復(fù))。

1.2.6 菌株SVY42-1生長條件及發(fā)酵條件測(cè)定參考東秀珠等［7］《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株生長條件及發(fā)酵條件等部分生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試。

1.2.7 葡萄糖及木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖及木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照徐秀忠和宋廣磊［8］的方法。

1.2.8 內(nèi)切葡聚糖酶(CMC 酶)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶活力測(cè)定 將1.0 mL的不同反應(yīng)底物(分別為CMC底物、1.0%水楊苷溶液及木聚糖溶液)和1.5 mL的DNS加入比色管，在41℃的溫度下溫浴10 min，加入粗酶液0.5 mL，反應(yīng)30 min，混勻后沸水浴顯色15 min，冷卻至室溫后定容到10 mL，用分光光度計(jì)520 nm測(cè)定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活。在上述條件下1.0 mL粗酶液1 min催化水解底物生成1 μmol還原糖(分別以葡萄糖、木糖計(jì))的量，定義為1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVY42菌群的富集培養(yǎng)

從－70℃冰箱中取出適量美國內(nèi)華達(dá)州大盆地溫泉采集樣品，接種于厭氧富集培養(yǎng)基中，平行接種3瓶，于40℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，經(jīng)過24 h后培養(yǎng)基變渾濁，液體表面有氣泡產(chǎn)生，培養(yǎng)至72 h后濾紙條開始逐漸崩解。選取濾紙條崩解較快的一瓶，進(jìn)行傳代富集培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定降解菌群SVY42-1，濾紙條崩解情況見圖1。

2.2 不同碳源培養(yǎng)條件下菌群3種酶活力測(cè)定

不同底物做碳源時(shí)，菌群的酶活存在較大差異。由圖2可以看出，在同樣的發(fā)酵條件下，不同的底物除CMC-Na外，均為木聚糖酶活力最高。菌群SVY42在以巨菌草作為碳源時(shí)的β-葡萄糖苷酶活最高為0.23 U/mL，以木聚糖作為碳源時(shí)CMC酶活和木聚糖酶活均為最高，分別為0.31 U/mL 和0.35 U/mL。

圖1 SVY42菌群降解濾紙情況Fig.1 The fiter paper degradation of SVY42

圖2 SVY42利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活的比較Fig.2 Comparison of xylanase production from different substrates by SVY42

2.3 菌群SVY42產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件分析

菌群SVY42在不同溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如圖3-A所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，木聚糖酶活逐漸變大，在供試溫度為42℃時(shí)菌群產(chǎn)木聚糖酶活較高，55℃時(shí)木聚糖酶活性反而降低，表明該菌群適合在中溫條件下產(chǎn)酶。菌群SVY42在不同起始pH值的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，如圖3-B所示，當(dāng)pH為8.0時(shí)木聚糖酶活達(dá)到最大值，該菌群為嗜弱堿性菌群。菌群SVY42最適條件下測(cè)定產(chǎn)酶時(shí)間變化，如圖3-C所示，菌群的木聚糖酶活力在培養(yǎng)至第4天時(shí)達(dá)到最大值，此后進(jìn)入產(chǎn)酶穩(wěn)定期，培養(yǎng)至第10天后，酶活力略有下降。

圖3 培養(yǎng)溫度(A)、pH值(B)和時(shí)間(C)對(duì)菌群SVY42產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of temperature(A)，pH values(B)and time(C)on xylanase production of consortia SVY42

2.4 產(chǎn)木聚糖酶厭氧菌株的篩選與鑒定

由2.2可知，菌群 SVY42在不同底物條件下，均表現(xiàn)出很好的木聚糖酶活性，為獲得高產(chǎn)木聚糖酶菌株提供依據(jù)。菌群SVY42經(jīng)木聚糖酶培養(yǎng)基初篩，并通過木聚糖酶粗酶液酶活力比較，得到1株編號(hào)為SVY42-1的木聚糖酶活性最大的菌株。菌株SVY42-1為中溫菌，最適生長溫度為41℃;在 pH 5.0～10.0均能生長，最適生長 pH值為8.0，在偏酸性或偏堿性條件下生長狀況較差。在最適生長條件下，菌株SVY42-1在培養(yǎng)至第4天時(shí)會(huì)達(dá)到其生長穩(wěn)定期，培養(yǎng)至第8天時(shí)，菌株生物量開始下降，逐漸進(jìn)入衰亡期;以最適初始pH值、最適培養(yǎng)溫度培養(yǎng)菌株SVY42-1，該菌在培養(yǎng)至第4天時(shí)產(chǎn)木聚糖酶活力達(dá)到最大值，在此后培養(yǎng)的第4～14天時(shí)間內(nèi)，木聚糖酶活力均處在較高的水平。

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得菌株SVY42-1的16S rDNA基因序列，采用Neighbor-joining構(gòu)建16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株 SVY42-1發(fā)現(xiàn)與 Tissierella praeacuta ATCC 25539T處于同一分支，見圖4，SVY42-1的16S rDNA基因與同源性最近的3 個(gè)菌株 Tissierella praeacuta ATCC 25539T、Sporanaerobacter acetigenes DSM 13106T和Tissierella creatinini DSM 9508T的序列同源性分別僅為93.81%、92.68% 和 92.66%，初步確定菌株SVY42-1屬于新的屬，菌株其他的生理生化等鑒定指標(biāo)正在進(jìn)行。

圖4 利用Neighbor-joining建樹法對(duì)菌株SVY42-1系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Unrooted neighbor-joining tree of strain SVY42-1 and related genera based on 16S rRNA gene sequences.Bar，0.2%sequence divergence

3 討論

細(xì)菌是自然界中半纖維素降解菌之一，降解半纖維素的細(xì)菌主要有厭氧梭菌(Clostridium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、雙芽胞桿菌屬(Amphibacillus)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)和土芽胞桿菌(Geobacillus)等［9-10］。目前為止，降解半纖維素的作用研究局限于木質(zhì)素類好氧單菌，而對(duì)天然半纖維素降解厭氧菌群了解較少。為提高半纖維素的降解效率，可采用菌群降解策略。本研究以濾紙作為單一碳源對(duì)采集自美國內(nèi)華達(dá)州大盆地溫泉樣品進(jìn)行富集，獲得了菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的降解菌群。對(duì)該菌群存在的降解酶系進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，具有較高內(nèi)切葡聚糖酶(CMC酶)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶活性，并從中篩選到1株高產(chǎn)木聚糖酶的厭氧單菌SVY42-1，經(jīng)16S rDNA鑒定與其他菌株的最高同源性僅為93.81%，有可能為一新的屬，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

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